Przełomowa wkładka oczna może zrewolucjonizować leczenie jaskry

Czym jest jaskra i jakie wyzwania stoją przed leczeniem?

Jaskra jest cichym zabójcą wzroku, charakteryzującym się podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym (IOP), prowadzącym do uszkodzenia nerwu wzrokowego. Miejscowe preparaty brinzolamidu (BRZ), inhibitora anhydrazy węglanowej, w postaci kropli do oczu są powszechnie stosowane w obniżaniu IOP podczas leczenia jaskry. Krople do oczu są najczęściej stosowanymi lekami okulistycznymi ze względu na łatwość podania miejscowego. Jednak mają one znaczące wady, takie jak niska biodostępność podawanego leku (z powodu wymiany łez powodującej rozcieńczenie leku i drenażu nosowo-łzowego), konieczność częstego dawkowania, niekontrolowane i niespójne dawki, niewyraźne widzenie oraz krótki czas przebywania w oku. Tradycyjne krople do oczu są szybko eliminowane z oka z powodu zwiększonej wymiany łez i wykazują krótszy czas przebywania w przedrogówkowej części oka (1-3 min), co umożliwia przenikanie <5% podanej dawki przez rogówkę i dotarcie do tkanek wewnątrzgałkowych. Ponadto właściwości fizykochemiczne leku, takie jak ładunek i hydrofilowość, mogą również utrudniać przenikanie leku.

Jakie innowacje zastosowano w nanotechnologii w leczeniu jaskry?

Ostatnio różne typy nanonośników, takie jak nanocząsteczki, liposomy, nanowłókna i nanożele, zostały wykorzystane do dostarczania leków przeciwjaskrowych. Naukowcy skupiają się głównie na nanocząsteczkach (NPs) do wprowadzania w postaci emulsji, zawiesin i żeli in-situ. Płynne nanonośniki mają większy potencjał obniżania ciśnienia wewnątrzgałkowego i mogą osiągnąć podobną przepuszczalność przy niższych dawkach dzięki zwiększonej biodostępności. Jednak w większości przypadków płynne nanonośniki nie zapewniają długotrwałej skuteczności terapeutycznej i nadal wymagają częstego podawania dawek. Miejscowe formulacje płynne omijają drogę rogówkową i najczęściej lokalizują się w przewodzie nosowo-łzowym i worku spojówkowym. Rogówka jest uważana za dominującą drogę przenikania leków hydrofobowych ze względu na lipofilny charakter nabłonka rogówki. Ponadto rogówka jest tkanką beznaczyniową i bezpośrednio połączoną z ciałem rzęskowym, co czyni ją preferowaną drogą podawania leków przeciwjaskrowych. W związku z tym zwiększenie ilości leku przeciwjaskrowego przenikającego przez rogówkę i zmniejszenie ilości przenikającej przez przewód nosowo-łzowy i spojówkę można osiągnąć za pomocą nanonośników w stanie stałym, przylegających ściśle do powierzchni rogówki, aby przeciwdziałać usuwaniu aż do uwolnienia leku.

Dlaczego elektroprzędzone nanowłókna budzą zainteresowanie?

Wśród alternatyw, elektroprzędzone nanowłókna jako miękki materiał do dostarczania leków przeciwjaskrowych zyskują znaczne zainteresowanie w dziedzinie okulistyki z ogromnym potencjałem. Nanowłókna (NFs) mogą łatwo dostosować się do twardówki i rogówki oraz pozostawać na powierzchni przez dłuższy czas, działając jako platforma do kontrolowanego uwalniania leku. Dlatego, w porównaniu do półstałych i płynnych formulacji, elektroprzędzone wkładki NFs mogą pokonać bariery rogówkowe, które powodują słabą biodostępność oczną leku po zastosowaniu miejscowym. NFs znacznie wydłużają czas przebywania na rogówce, a także poprawiają stężenie leków w cieczy wodnistej. Ponadto NFs mogą tworzyć stabilny gradient leku, który umożliwia dyfuzję leków hydrofilowych i lipofilowych przez powierzchnię oka.

Jakie korzyści niosą β-CD i chitosan w systemach okulistycznych?

Beta-cyklodekstryna (β-CD) jest cyklicznym polisacharydem złożonym z 7 jednostek glukozy połączonych wiązaniami glikozydowymi α-1,4. Jej struktura tworzy ścięty stożek (toroid), z hydrofobową wewnętrzną jamą (dzięki grupom C-H i tlenowym grupom glikozydowym) i hydrofilowym zewnętrzem (z grup hydroksylowych). Ta unikalna architektura umożliwia jej przyjmowanie hydrofobowych cząsteczek w swojej jamie poprzez oddziaływania niekowalencyjne. Wykazano, że β-CD zwiększa rozpuszczalność, stabilność, biodostępność i przepuszczalność przenoszonych leków. Z drugiej strony, chitosan (CH) ma silne właściwości mukoadhezyjne dzięki dodatniemu ładunkowi, który przylega do ujemnie naładowanej błony śluzowej spojówki, zwiększając retencję leku i zmniejszając potrzebę częstego podawania.

Czy nowa wkładka oczna NPs-in-NFs to przełom w terapii jaskry?

W tym badaniu opracowano pojedynczą dawkę NPs-in-NFs, która zawiera odpowiednią ilość BRZ, do zastosowania jako wkładka oczna z przedłużonym uwalnianiem leku w leczeniu jaskry. Nanocząsteczki zawierające BRZ (BRZ NPs) zostały przygotowane w sposób ułatwiający przedłużone uwalnianie leku i zwiększoną zdolność penetracji dzięki hydrofilowo-hydrofobowemu charakterowi BRZ NPs. Przygotowane BRZ NPs zostały zintegrowane podczas procesu elektroprzędzenia wewnątrz nanowłókien, tworząc elektroprzędzone NPs-in-NFs jako końcową postać dawkowania do podania do worka spojówkowego oka.

Badanie składało się z czterech faz. Pierwsza faza obejmowała optymalizację, przygotowanie i charakterystykę nanocząsteczek BRZ z wykorzystaniem chondroitinianu siarczanu (Cs) i β-CD, przy użyciu zoptymalizowanego stosunku Cs i β-CD w celu ułatwienia przedłużonego uwalniania BRZ. Druga faza obejmowała asymilację zoptymalizowanych BRZ NPs do elektroprzędzonych matryc nanowłókien z chitosanu (CH) i polikaprolaktonu (PCL), które miały być używane jako mukoadhezyjne wkładki oczne NPs-in-NFs. Trzecia faza obejmowała badania ex vivo do oceny toksyczności komórkowej in vitro, przepuszczalności rogówkowej i właściwości mukoadhezyjnych wkładki NPs-in-NFs. Ostatecznie przeprowadzono badanie in vivo na królikach jako zwierząt modelowych w celu oceny czasu przebywania w cieczy wodnistej, skuteczności przeciwjaskrowej i bezpieczeństwa biologicznego wkładki NPs-in-NFs.

Projekt ten wykorzystał po raz pierwszy integrację nanocząsteczek z brinzolamidem (BRZ-NPs) w mukoadhezyjnych nanowłóknach (NFs) do terapii jaskry, łącząc podwójne zalety NPs (kontrolowane uwalnianie) i NFs (przedłużony czas przebywania) z trzema ważnymi aspektami: (i) wkładka oczna NPs-in-NFs wykazała dwufazowy profil uwalniania leku przez dłuższy okres, co rozwiązuje problem słabej biodostępności i krótkiego czasu przebywania kropli do oczu i może być pomocne w pokonywaniu wtórnych barier ocznych, takich jak drenaż nosowo-łzowy, mruganie oczu i wymiana łez, które sprzyjają szybkiej eliminacji leku; (ii) wkładka oczna NPs-in-NFs eliminuje potrzebę powtarzanego podawania dawek i poprawia współpracę pacjentów; (iii) wkładka oczna NPs-in-NFs zmniejsza toksyczność systemową/wizualną dzięki precyzyjnemu i zlokalizowanemu dostarczaniu z dużymi powierzchniami, które umożliwiają kontakt dużej powierzchni zawierającej lek z miejscem choroby. W skrócie, hybrydowy system NPs-in-NFs łączy nanotechnologię (NPs do kontrolowanego uwalniania) i inżynierię biomateriałów (NFs do mukoadhezji) w jednorazowym i klinicznie wykonalnym systemie, oferując zmianę paradygmatu w leczeniu jaskry.

Jak przygotowano i scharakteryzowano BRZ NPs?

Nanocząsteczki BRZ zostały przygotowane metodą nanoprecypitacji. 10 mL wodnego roztworu Cs i β-CD przygotowano w stosunku molowym 1:1, a następnie dodano kroplami 2 mL etanolu zawierającego BRZ (5 mg/mL) przy ciągłym mieszaniu i pozostawiono mieszaninę do reakcji inkluzji na 5 godzin przy 500 obr/min. Następnie bezwodny etanol (20 mL) został użyty jako czynnik przeciwrozpuszczalnikowy i dodany kroplami do mieszaniny Cs/β-CD-BRZ w celu przygotowania BRZ NPs w temperaturze pokojowej przy mieszaniu magnetycznym. Po dodaniu całego bezwodnego etanolu, mieszaninę pozostawiono pod mieszaniem magnetycznym przy 500 obr/min przez 30 minut. Nanocząsteczki wytrąciły się spontanicznie i uzyskano zawiesinę BRZ NPs. Zawiesinę odwirowano w celu oddzielenia BRZ NPs, a następnie liofilizowano. Uzyskane BRZ NPs przechowywano w temperaturze 4°C do dalszych analiz.

Analiza rozpuszczalności fazowej BRZ/β-CD wykazała, że β-CD znacznie zwiększa rozpuszczalność BRZ w PBS, potwierdzając interakcję gospodarz-gość między BRZ i β-CD. Maksymalną rozpuszczalność BRZ (3,1 ± 0,12 mM) osiągnięto przy stężeniu β-CD wynoszącym 7,0 mM, a rozpuszczalność BRZ zmniejszyła się przy stężeniu β-CD poniżej punktu rozpuszczalności, reprezentując krzywą rozpuszczalności fazowej typu B według klasyfikacji Higuchiego i Connorsa. Stała stabilności (Kc; 156,7 M^–1) i wydajność kompleksowania (CE; 0,203) wskazują na silną interakcję BRZ z β-CD w celu utworzenia stabilnego kompleksu.

Pomyślne wytworzenie BRZ NPs zostało początkowo potwierdzone za pomocą mikroskopii TEM. BRZ NPs wykazują okrągły kształt ze średnią średnicą 35,2 ± 7,5 nm. Ponadto BRZ NPs wykazały średnią wielkość cząstek dyspersji 53,5 ± 4,6 nm z indeksem polidyspersyjności (PDI) 0,22 i wartością potencjału zeta −35,2 ± 1,6 mV. Średnia wielkość cząstek dyspersji lub hydrodynamiczna wielkość cząstek BRZ NPs była nieco większa w porównaniu do wielkości TEM, co może być spowodowane otoczeniem wodnym lub hydratacją wokół BRZ NPs w formie dyspersji. Pomyślne enkapsulowanie BRZ w BRZ NPs zostało potwierdzone przez FTIR i spektrum UV. Widmo FTIR BRZ NPs wykazało charakterystyczne piki odpowiednich składników, takich jak BRZ, Cs i β-CD, z niewielkimi przesunięciami, potwierdzając pomyślne interakcje w BRZ NPs i wykazując odpowiednie ładowanie leku (11,6 ± 2,0%) i wydajność enkapsulacji (82,5 ± 2,8%).

Widmo XRD nanocząsteczek BRZ ujawniło nieznaczne charakterystyczne piki BRZ o niskiej intensywności, co wskazuje, że BRZ stracił swoją krystaliczną naturę i uzyskał częściową amorfizację po załadowaniu do nanocząsteczek. Nanocząsteczki o amorficznej naturze szybko tworzą roztwór z medium wodnym ze względu na słabe ruchy molekularne i energię wewnętrzną.

Jak kontrolowane uwalnianie BRZ wpływa na skuteczność leczenia?

Dalej oceniono profil uwalniania BRZ z kropli do oczu stosowanych klinicznie (Azopt®) i BRZ NPs. BRZ z kropli do oczu Azopt® wykazał szybkie uwalnianie w ciągu pierwszych 2 godzin (84,60 ± 2,24%) i cały BRZ został uwolniony po 8 godzinach, wskazując na prostą dyfuzję leku z przedziału o wysokim stężeniu do przedziału o niskim stężeniu. W przeciwieństwie do tego, enkapsulacja BRZ w BRZ NPs znacząco kontroluje uwalnianie BRZ z około 61,75 ± 2,52% uwolnienia w ciągu 24 godzin, a następnie przedłużone i ciągłe uwalnianie BRZ do 168 godzin z około 89,12 ± 2,84% uwolnienia BRZ. Powolne uwalnianie BRZ z BRZ NPs w porównaniu do kropli do oczu Azopt® potwierdziło enkapsulację BRZ w rdzeniu nanocząsteczek. Jednak uwalnianie BRZ z BRZ NPs wzrosło do 66,72 ± 2,48% i 98,2 ± 2,14% w ciągu 24h i 168h, odpowiednio, gdy inkubowano z lizozymem (1000 μg mL⁻¹). Wzrost uwalniania leku przypisano rozszczepieniu wiązań glikozydowych β-1,4 w strukturze Cs, gdy wchodzi w kontakt z lizozymem, który jest obficie obecny w płynie łzowym.

Jak elektroprzędzone nanowłókna wpływają na właściwości nośnika BRZ?

Puste i załadowane BRZ NPs nanowłókna zostały przygotowane techniką elektroprzędzenia. Roztwór chitosanu (CH) (3% v/v) i roztwór polikaprolaktonu (PCL) (12% v/v) przygotowano przez rozpuszczenie 0,3 g CH i 1,2 g PCL odpowiednio w kwasie octowym (10%) i heksafluoro izopropanolu. Następnie roztwór CH i PCL zmieszano w różnych stosunkach objętościowych, takich jak 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1. Średnica nanowłókien CH/PCL znacznie wzrasta wraz ze wzrostem stosunku objętościowego PCL (1-5) i zmniejszeniem stosunku objętościowego CH (9-5), nanowłókna CH/PCL bez koralików ze średnią średnicą (180 ± 15 nm) zostały elektroprzędzone przy stosunku objętościowym 5:5. Jednak dalszy wzrost stosunku objętościowego PCL (7-9) i spadek stosunku objętościowego CH (3-1) spowodowały wzrost lepkości roztworu do elektroprzędzenia, co prowadzi do dalszego wzrostu średnicy nanowłókien do 570 ± 65 nm. Wzrost stosunku objętościowego PCL i spadek stosunku objętościowego CH mogą powodować zmniejszenie przewodnictwa elektrycznego i napięcia powierzchniowego roztworu CH, co prowadzi do zwiększenia średnicy nanowłókien.

Biorąc pod uwagę odpowiednią średnicę i morfologię powierzchni NFs do zastosowania ocznego, NFs o średnicy 180 ± 15 nm uzyskane po elektroprzędzeniu roztworu PCL/CH zawierającego równe proporcje objętościowe PCL:CH (5:5) zostały wybrane do załadowania BRZ NPs i NPs-in-NFs zostały elektroprzędzone w tych samych warunkach. Mikrografie SEM NPs-in-NFs nie wykazały widocznych zmian w morfologii powierzchni po elektroprzędzeniu z BRZ NPs, wskazując na całkowite uwięzienie BRZ NPs w NPs-in-NFs. Jednak zaobserwowano niewielki wzrost średnicy NPs-in-NFs (205 ± 15 nm) w porównaniu do pustych NFs (180 ± 15 nm), co może być spowodowane załadowaniem BRZ NPs.

Pomyślne załadowanie BRZ NPs do wkładki NPs-in-NFs zostało potwierdzone przez analizę FTIR poprzez porównanie widma FTIR NPs-in-NFs z BRZ NPs, pustymi NFs, PCL i CH. Widmo FITR NPs-in-NFs ujawniło przypisane piki CH odpowiadające zginaniu NH₂ przy 3301 cm⁻¹, asymetrycznemu rozciąganiu C-H przy 2877 cm⁻¹, rozciąganiu C=O amidu-I przy 1645 cm⁻¹, asymetrycznemu rozciąganiu wiązania C-O-C przy 1153 cm⁻¹ i rozciąganiu C-O przy 1066 cm⁻¹. Charakterystyczne piki PCL zaobserwowano przy 2947 cm⁻¹ (rozciąganie C–H), przy 1732 cm⁻¹ (rozciąganie C=O), przy 1295 cm⁻¹ (rozciąganie C–C i C–O), przy 1241 cm⁻¹ (symetryczne rozciąganie C–O–C) i przy 1174 cm⁻¹ (asymetryczne rozciąganie C–O–C). Ponadto przypisane piki odpowiednich składników BRZ NPs również zaobserwowano w widmie NPs-in-NFs z niewielkim przesunięciem pików, wskazującym na wiązania wodorowe między BRZ NPs a CH/PCL w NPs-in-NFs, potwierdzając załadowanie BRZ NPs do NPs-in-NFs.

Widmo XRD dla CH, PCL, pustych NFs, BRZ NPs i NPs-in-NFs wykazało, że charakterystyczne piki BRZ w BRZ NPs zniknęły po elektroprzędzeniu do NPs-in-NFs. Wskazuje to na elektroprzędzenie amorficznych NPs-in-NFs dla zwiększonej rozpuszczalności i przepuszczalności, co jest korzystne dla zastosowania ocznego. Ponadto przeprowadzono analizę elementarną mikrografii SEM NPs-in-NFs bez CS, wykorzystując siarkę (S) jako marker chemiczny obecny w strukturze BRZ. Wyniki ujawniły spójny rozkład BRZ wewnątrz NPs-in-NFs podczas procesu elektroprzędzenia.

Jakie właściwości fizykochemiczne wyróżniają wkładkę NPs-in-NFs?

Mechaniczne właściwości, w tym moduł sprężystości (EM), wytrzymałość na rozciąganie (TS) i wydłużenie przy zerwaniu NPs-in-NFs, zostały zbadane. Puste NFs wykazały wyższy EM (31,2 MPa) i TS (2,55 MPa), jednak po włączeniu BRZ NPs, EM i TS wkładki NPs-in-NFs znacznie zmniejszyły się do 18,5 MPa i 1,72 MPa, odpowiednio. Ponadto wkładka NPs-in-NFs wykazuje znaczne zmniejszenie wydłużenia w punkcie zerwania w porównaniu do pustych NFs. Zwiększenie kruchości NPs-in-NFs spowodowane jest obecnością BRZ NPs w matrycy NFs, które zakłócają strukturalną ciągłość pustych NFs.

Ponadto określono stopień pęcznienia wkładki NPs-in-NFs w celu zbadania stopnia hydrofobowości zarówno pustych NFs, jak i wkładki NPs-in-NFs. Puste NFs i wkładka NPs-in-NFs osiągnęły maksymalny stopień pęcznienia, a ich waga znacznie wzrosła do ponad 200% w ciągu pierwszych 30 minut. Zaobserwowano, że wkładka NPs-in-NFs ma nieco zmniejszoną zdolność pęcznienia, co może być spowodowane dużą ilością BRZ NPs w porównaniu do pustych NFs.

Test przepuszczalności pary wodnej (WVP) przeprowadzono zgodnie z protokołem ASTM, aby zapewnić zdolność opracowanej wkładki NPs-in-NFs do utrzymania płynów łzowych i perfuzji powietrza po wprowadzeniu do oczu. Zarówno puste NFs, jak i wkładka NPs-in-NFs posiadają wysoką zdolność WVP. Jednak nie zaobserwowano znaczącej różnicy w zdolności WVP między pustymi NFs a wkładką NPs-in-NFs, co zapewnia jednorodną dystrybucję BRZ NPs w wkładce NPs-in-NFs bez tworzenia koralików lub zatykania porów podczas elektroprzędzenia.

Porowatość NPs-in-NFs została również oceniona w celu oszacowania procentowej porowatości w stosunku do objętości wkładki ocznej. Wysoka porowatość jest wymagana, aby zapewnić odpowiedni przepływ płynów łzowych i tlenu, gdy wkładka oczna jest umieszczona wewnątrz oczu. Procentowa porowatość wkładki NPs-in-NFs i pustych NFs została oceniona za pomocą piknometru. Wkładka NPs-in-NFs i puste NFs nie wykazały istotnej różnicy w porowatości, ponieważ obie mają ponad 90 ± 3% porowatości w stosunku do swojej objętości.

Czy wkładka NPs-in-NFs wykazuje odpowiednią biodegradowalność?

Stopień biodegradacji NPs-in-NFs zbadano, aby zapewnić łatwą i bezpieczną degradację opracowanej wkładki ocznej NPs-in-NFs. Wyniki wykazały, że zarówno puste NFs, jak i NPs-in-NFs są wysoce biodegradowalne, ponieważ matryca NFs składa się z PCL i CH, polimerów o udokumentowanej biokompatybilności i biodegradowalności, o szerokim zastosowaniu medycznym. Ponadto stwierdzono, że około 24,58 ± 2,58% wkładki NPs-in-NFs uległo degradacji w ciągu 2 godzin inkubacji, co może być spowodowane powolną erozją objętościową, która obejmuje pęcznienie, a następnie rozerwanie łańcucha w środowisku wodnym. Jednak stopień degradacji wzrasta do 52,67 ± 2,83% w obecności lizozymu (1000 mL), który rozszczepia wiązania glikozydowe (β-1,4) zarówno w strukturze CS, jak i CH.

Jakie zmiany w profilu uwalniania wprowadza integracja BRZ NPs w nanowłóknach?

Włączenie BRZ NPs do NPs-in-NFs ujawniło niewielkie opóźnienie w uwalnianiu BRZ, ponieważ 31,52 ± 2,20%, 51,84 ± 2,75% i 85,69 ± 2,32% uwolniło się odpowiednio w ciągu pierwszych 4, 12 i 168 godzin, w porównaniu do uwalniania leku z BRZ NPs. Jednak uwalnianie BRZ z NPs-in-NFs wzrosło do 56,26 ± 2,12%, 73,32 ± 2,38%, 97,52 ± 2,2,56% odpowiednio w ciągu pierwszych 4, 12 i 168 godzin, gdy inkubowano z lizozymem (1000 μg mL⁻¹). Wzrost uwalniania leku przypisano rozszczepieniu wiązań glikozydowych β-1,4 w CH, gdy wchodzi w kontakt z lizozymem obficie obecnym w płynie łzowym.

Profil uwalniania BRZ z NPs-in-NFs został dopasowany do matematycznego modelu Peppasa-Sahlina (prawo potęgowe). NPs-in-NFs wykazały złożone profile uwalniania leku, dyfuzję typu Ficka i relaksację łańcuchów polimerowych. Według modelu Peppasa-Sahlina, wartość ‘n’ (<1) sugerowała dyfuzję Ficka. Ponadto współczynniki Peppasa-Sahlina sugerowały szybsze uwalnianie leku przy wyższej wartości k1 (34,48) i przesunięcie w kierunku mechanizmu uwalniania opartego na relaksacji łańcucha polimerowego przy bardziej ujemnej wartości k2 (-3,17) w obecności lizozymu, który powoduje rozszczepianie wiązań glikozydowych β-1,4 w CH.

Czy NPs-in-NFs są biokompatybilne w badaniach in vitro?

Biosafety in vitro NPs-in-NFs oceniono w komórkach RbCEpC za pomocą testu live/dead. Odsetek żywych komórek w RbCEpC traktowanych NPs-in-NFs był podobny do kontroli (nietraktowanych) RbCEpC, co wskazuje na zwiększone bezpieczeństwo biologiczne i biokompatybilność NPs-in-NFs, ponieważ odpowiednie składniki, takie jak CH, PCL, CS i β-CD, są uniwersalnymi biokompatybilnymi materiałami, które czynią NPs-in-NFs odpowiednimi do zastosowania in vivo.

Jakie są właściwości mukoadhezyjne wkładki NPs-in-NFs?

Mukoadhezja jest uważana za ważny parametr w dostarczaniu leków okulistycznych, który wskazuje na czas przebywania nanoformulacji wewnątrz oka. Wartości przyłożonej siły i pracy mukoadhezji NPs-in-NFs znacznie zmniejszyły się w warunkach mokrych w porównaniu do formy suchej. Ponadto zdolność mukoadhezji proponowanych NPs-in-NFs została wzmocniona i przedłużona przez interakcję łańcuchów polimerowych z błoną śluzową, co było ułatwione przez dużą powierzchnię NFs. Dodatkowo dodatnie ładunki powierzchniowe NFs-in-NFs ze względu na grupy aminowe polimeru CH ułatwiły aktywne wiązanie z ujemnie naładowanymi glikoproteinami mucyny na powierzchni oka (np. śluzówką rogówki i spojówki), zakotwiczając osadzone NPs w wewnętrznych segmentach oka. Mukoadhezja chitosanu zmniejsza wypłukiwanie BRZ-NPs przez przepływ łez, podczas gdy stabilność mechaniczna PCL opiera się dezintegracji pod wpływem naprężeń ścinających (np. ruchu powiek). Właściwości adhezyjne minimalizują utratę leku przez przewód nosowo-łzowy, główną drogę usuwania leku z oka. Z drugiej strony, absorpcja wody może prowadzić do bardziej spęczniałego stanu mokrych NPs-in-NFs, co może osłaniać te aktywne miejsca i zmniejszać ogólną siłę adhezji. Dlatego aplikacja suchych NPs-in-NFs do worka spojówkowego jest bardziej obiecująca w leczeniu jaskry w porównaniu do mokrych.

Czy wkładka NPs-in-NFs poprawia przenikalność rogówki?

Następnie zbadano przepuszczalność rogówki ex vivo NPs-in-NFs, aby zrozumieć interakcję rogówki z opracowaną wkładką NPs-in-NFs, co daje obiecujący wgląd w ich potencjał terapeutyczny i biodostępność leku i jest uważane za decydujący parametr w dostarczaniu leków okulistycznych. Przenikanie wkładki NPs-in-NFs było nieco wyższe w porównaniu do kropli do oczu Azopt® w początkowym punkcie czasowym (1h), jednak przenikanie wkładki NPs-in-NFs znacznie wzrosło w kolejnych godzinach, osiągając średnią wartość 62,34 ± 2,4 μg/cm² i 39,06 ± 1,9 μg/cm², odpowiednio. Zwiększone przenikanie może być spowodowane dużą powierzchnią, wyższą mukoadhezją, zwiększoną rozpuszczalnością i małym rozmiarem cząstek wkładki NPs-in-NFs. Ponadto β-CD i CH działają również jako wzmacniacze przenikania i promują podział leku w błonie rogówkowej. CH przejściowo otwiera ścisłe połączenia nabłonka rogówki, poprawiając transport pozakomórkowy BRZ-NPs.

Czy formulacja oczna NPs-in-NFs minimalizuje podrażnienia?

Ciągła ekspozycja oka na środowisko ułatwia atak każdego czynnika chemicznego lub fizycznego, który może potencjalnie powodować podrażnienie, uraz lub upośledzenie wzroku. Dlatego ocena potencjału podrażnienia formulacji, która może mieć kontakt z powierzchnią oka, jest konieczna. Nowa formulacja z najniższym lub nieznacznym podrażnieniem po aplikacji jest uważana za bezpieczną do stosowania ocznego. Wszystkie króliki wykazały przezroczystą rogówkę z normalną powierzchnią oczną na początku (t = 0 h) testu podrażnienia oka. Pozytywna kontrola (2% SDS) powoduje silne zaczerwienienie z obrzękiem spojówki powiekowej i gałkowej z wynikiem 4 po 6 godzinach i zwiększa wydzielanie śluzu. Ponadto zaobserwowano otarcia rogówki z zielonym sygnałem po oświetleniu niebieskim światłem po 6 godzinach podania 2% SDS. Krople do oczu Azopt® początkowo wywołują zaczerwienienie w pierwszej godzinie instalacji z wynikiem 3 i zmniejszają się do 0 po 6 godzinach bez zaczerwienienia. Podrażnienie spowodowane kroplami do oczu Azopt® w pierwszej godzinie może być spowodowane bezpośrednim kontaktem BRZ z powierzchnią oczną. Jednak nie zaobserwowano widocznego zaczerwienienia po podaniu NPs-in-NFs z wynikiem w zakresie 2-0 w okresie eksperymentalnym 1-6 godzin. Formulacja oczna z wynikiem 0-2 jest uważana za niedrażniącą i nie spowoduje uszkodzenia powierzchni ocznej. Dlatego NPs-in-NFs z wartością wyniku (2-0) są bezpieczne do stosowania ocznego.

Jakie efekty wykazuje NPs-in-NFs na strukturę oka?

Obrazy endoteliometrii i OCT oczu królików przed i po leczeniu wykazały, że morfologia komórek śródbłonka rogówki królików pozostała niezmieniona po leczeniu w porównaniu z komórkami śródbłonka rogówki przed leczeniem i grupą kontrolną. Ponadto nie zaobserwowano oczywistych zmian w grubości, morfologii i strukturze rogówki analizowanej przez OCT, co wskazuje na bezpieczeństwo biologiczne NPs-in-NFs. Potwierdza to, że wkładka NPs-in-NFs nie wykazała toksyczności dla komórek śródbłonka rogówki i siatkówki po podaniu. W skrócie, analiza endoteliometrii i OCT komórek rogówki i siatkówki wskazuje, że NPs-in-NFs są obiecujące do stosowania ocznego bez widocznej toksyczności.

Czy wkładka NPs-in-NFs wydłuża czas przebywania leku w oku?

Przedłużony czas przebywania w oku jest niezbędny do zwiększenia skuteczności terapeutycznej systemu nanonośnika zawierającego lek. Aby zbadać czas przebywania w oku, zdrowym królikom podano wkładkę NPs-in-NFs i krople do oczu Azopt® jako kontrolę. Stężenia leku w cieczy wodnistej obserwowano przez 24 godziny po podaniu poprzez pomiar stężenia BRZ. Po podaniu pojedynczej dawki NPs-in-NFs i Azopt®, uzyskano średni profil stężenia w czasie w cieczy wodnistej. Wkładka NPs-in-NFs wykazała długi czas przebywania w oku, ponieważ stężenie BRZ w cieczy wodnistej było dobrze utrzymane przez 24 godziny od podania. W przeciwieństwie do tego, stężenie BRZ w cieczy wodnistej królików, którym podano krople do oczu Azopt®, gwałtownie spadło po 3 godzinach od podania. Do uzyskania parametrów farmakokinetycznych z krzywej stężenia w cieczy wodnistej w czasie zastosowano jednokompartmentowy model farmakokinetyczny. Wkładka NPs-in-NFs wykazała końcowy okres półtrwania (t_1/2) około 6 godzin, podczas gdy t_1/2 kropli do oczu Azopt® wynosił 1 godzinę. Pole pod krzywą (AUC), C_max, t_max wkładki NPs-in-NFs wzrosło w porównaniu do kropli do oczu Azopt®. Wzrost parametrów farmakokinetycznych wkładki NPs-in-NFs może być wywołany dużą powierzchnią, przedłużonym profilem uwalniania leku i siłą mukoadhezji. Przedłużony czas przebywania w oku może być pomocny w zmniejszeniu częstotliwości dawek, a także poprawić współpracę pacjentów w leczeniu jaskry.

Czy NPs-in-NFs skutecznie obniża ciśnienie wewnątrzgałkowe?

Skuteczność obniżania IOP in vivo przez NPs-in-NFs badano w modelu jaskry z nadciśnieniem, używając królików jako zwierząt modelowych. Model oka z nadciśnieniem został wywołany przez wstrzyknięcie alfa-chymotrypsyny poprzez wstrzyknięcia do komory przedniej w prawym oku królika. Aby zachować dobrostan zwierząt, lewe oko królika nie było poddawane interwencji. IOP mierzono za pomocą Tonovet (Tonovet Plus, iCare, Finlandia), który ułatwia pomiar IOP bez stosowania znieczulenia miejscowego. IOP o godzinie 0 (przed leczeniem) ustawiono jako odczyt bazowy. Jedna kropla (10,0 μL) kropli do oczu Azopt® i wkładka NPs-in-NFs o wymiarach 1,5 × 0,5 cm z równoważnym stężeniem BRZ (100,0 μg) zostały umieszczone w worku spojówkowym prawego oka każdego królika z jaskrą.

Jak NPs-in-NFs wpływają na progresję jaskry?

Ponadto przeprowadzono badanie fundoskopowe oka królika w celu oceny progresji jaskry. Ze względu na różnice anatomiczne między okiem królika a człowieka, bezpośrednie porównanie pionowego stosunku zagłębienia do tarczy (CDR) jest trudne. Dlatego na obrazach dna oka tarcza nerwu wzrokowego jest oznaczona niebieską przerywaną linią, a zasięg zagłębienia jest zaznaczony zieloną przerywaną linią. Następnie wykorzystano stosunek powierzchni (zielona powierzchnia do niebieskiej powierzchni) jako analog CDR. Widoczne jest, że stosunek powierzchni w zielonej przerywanej linii (zagłębienie) do powierzchni w niebieskiej przerywanej linii (tarcza) jest stosunkowo mały w oczach leczonych NPs-in-NFs z modelem wysokiego IOP w porównaniu do kropli do oczu Azopt®, który jest powiększony w porównaniu do normalnego oka, ale pozostaje mniejszy niż w grupie z wysokim IOP. Ten stosunek powierzchni jest wyraźnie zwiększony w modelu jaskry z wysokim IOP w porównaniu do kontroli.

Ponadto grubość kompleksu komórek zwojowych (GCC) siatkówki zmierzono za pomocą OCT. Grubość warstwy GCC w siatkówce leczonej NPs-in-NFs znacznie się poprawiła w porównaniu do grupy leczonej kroplami do oczu Azopt® i grupy modelu wysokiego IOP. U pacjentów z jaskrą długotrwała ekspozycja na podwyższone IOP prowadzi do apoptozy komórek zwojowych siatkówki (RGC) i utraty aksonów, co skutkuje ścieńczeniem warstw siatkówki, szczególnie w obrębie warstw GCC. Dlatego uzyskane wyniki sugerują zwiększoną biodostępność leku, ponieważ podwójny system dostarczania może podtrzymać efekt BRZ wewnątrz oka przez dłuższy okres czasu dzięki przedłużonemu uwalnianiu leku, zwiększonej penetracji i przedłużonemu przebywaniu w oku, jak wykazano w badaniach in vitro, ex vivo i in vivo.

Czy NPs-in-NFs są bezpieczne dla całego organizmu?

Ocena systemowego bezpieczeństwa biologicznego jest kluczowa dla określenia klinicznego zastosowania każdego nanomedykamentu. Dlatego systemową toksyczność NPs-in-NFs oceniono u zdrowych królików poprzez monitorowanie barwionych H&E sekcji głównych narządów, pełnej morfologii krwi (CBC) i parametrów biochemicznych surowicy. Barwione H&E sekcje rogówki, siatkówki, serca, wątroby, płuc, śledziony i nerek pobranych od królików leczonych NPs-in-NFs nie wykazały oczywistych zmian patologicznych w porównaniu do grupy kontrolnej. Ponadto nie zaobserwowano oczywistych zmian w rutynowym teście CBC, a także markery funkcji wątroby, w tym aminotransferaza asparaginianowa (AST), fosfataza alkaliczna (ALP) i aminotransferaza alaninowa (ALT), oraz markery funkcji nerek, takie jak kreatynina w surowicy (CRE) i azot mocznikowy we krwi (BUN), również pozostały w normalnych zakresach.

Ponadto nie zaobserwowano widocznych zmian w poziomie cytokin zapalnych (IL-6 i IL-2) w cieczy wodnistej królików, którym podano wkładkę NPs-in-NFs, w porównaniu do grupy kontrolnej (nieleczonej). Wyniki te sugerują, że NPs-in-NFs nie wywołały toksycznych efektów na funkcję wątroby, nerek i odpowiedzi zapalne, dodatkowo potwierdzając bezpieczeństwo biologiczne NPs-in-NFs. Połączone analizy histopatologiczne i biochemiczne dostarczają silnych dowodów na biokompatybilność i bezpieczeństwo biologiczne NPs-in-NFs. Brak znaczącej toksyczności w głównych narządach i normalne markery funkcji wątroby/nerek wraz z normalnym CBC wspierają potencjał NPs-in-NFs do bezpiecznego stosowania in vivo. Ponadto analiza histopatologiczna nie wykazuje oczywistych zmian w architekturze rogówki, siatkówki i głównych tkanek w porównaniu do kontrolnego (nieleczonego) oka. Przekrój rogówki z oka leczonego NPs-in-NFs wykazał nienaruszone, zdrowe warstwy rogówki, które składały się z warstwy Bowmana, nabłonka, błony Descemeta, zrębu i śródbłonka, tak samo jak kontrolne (nieleczone) oko, wskazując na długoterminowe bezpieczeństwo biologiczne NPs-in-NFs. Wyniki te są kluczowe dla postępu wkładki NPs-in-NFs w kierunku zastosowań klinicznych.

Czy jednorazowa wkładka NPs-in-NFs zmienia paradygmat leczenia jaskry?

W tym badaniu NPs-in-NFs zostały zbadane jako wkładka oczna jednorazowej dawki poprzez asymilację BRZ załadowanych NPs do elektroprzędzonych NFs, aby osiągnąć różne korzyści, takie jak ciągłe uwalnianie leku z ciągłą szybkością, zwiększony kontakt oczny i czas przebywania, precyzyjne dostarczanie dawki, przedłużony efekt terapeutyczny, zmniejszona dawka i częstotliwość jej podawania, poprawiona biodostępność, znikoma częstość występowania systemowych i wizualnych efektów ubocznych. Potencjał przygotowanych wkładek ocznych NPs-in-NFs jako jednorazowej, nieinwazyjnej strategii leczenia jaskry został wykazany przez miejscowe podanie do oka królika. Jednak dalsza dogłębna ocena opracowanej wkładki ocznej NPs-in-NFs, taka jak optymalizacja dawkowania, właściwości mechanicznych, więcej badań komórkowych, częstotliwość dawek, badania przedkliniczne i kliniczne, będzie rozważana w naszej przyszłej pracy.

Podsumowanie

Przedstawione badanie koncentruje się na innowacyjnym rozwiązaniu w leczeniu jaskry poprzez opracowanie wkładki ocznej NPs-in-NFs (nanocząsteczki w nanowłóknach) zawierającej brinzolamid. System ten łączy zalety nanocząsteczek (kontrolowane uwalnianie leku) z nanowłóknami (przedłużony czas przebywania w oku) w jednorazowej dawce. Wkładka wykazała znaczącą skuteczność w obniżaniu ciśnienia wewnątrzgałkowego, przy jednoczesnym wydłużonym czasie działania do 168 godzin. Badania potwierdziły wysoką biokompatybilność, biodegradowalność oraz minimalne podrażnienie oczu. W porównaniu do konwencjonalnych kropli do oczu (Azopt®), NPs-in-NFs zapewnia lepszą biodostępność leku, dłuższy czas przebywania w oku oraz wymaga rzadszego dawkowania. Wyniki badań in vitro, ex vivo i in vivo potwierdziły bezpieczeństwo systemu oraz brak toksyczności systemowej, co stanowi obiecującą alternatywę dla obecnie stosowanych metod leczenia jaskry.