- Które z czterech ludzkich syntetaz chondroityny faktycznie katalizują elongację łańcucha CS, a które pełnią wyłącznie funkcję stabilizacyjną
- Jak wygląda struktura przestrzenna kompleksu CHSY3-CHPF rozwiązana metodą cryo-EM przy rozdzielczości 3,0 Å
- Dlaczego mutacje w kluczowych resztach katalitycznych całkowicie znoszą biosyntezę chondroityny
- W jaki sposób odkrycie mechanizmu biosyntezy CS może przełożyć się na terapię osteoartrozy i nowotworów
Jak ludzkie komórki budują chondroitynę – nowy model heterodimeryczny
Siarczany chondroityny (CS) to złożone polisacharydy obecne na powierzchni komórek i w macierzy zewnątrzkomórkowej niemal wszystkich wyższych organizmów eukariotycznych. Proteoglikany chondroityny (CSPG) regulują szeroki zakres procesów komórkowych – od sygnalizacji i morfogenezy po przebudowę macierzy i plastyczność neuronalną. Defekty w maszynerii biosyntezy CS wiążą się z osteoartrozą, stanami zapalnymi, infekcjami oraz różnymi nowotworami.
Biosynteza CS zachodzi w świetle aparatu Golgiego i polega na polimeryzacji szkieletu z powtarzających się jednostek disacharydowych (GlcA-GalNAc). Dotychczas cztery geny ludzkie – CHSY1, CHSY3, CHPF i CHPF2 – były kojarzone z wydłużaniem łańcucha CS, jednak ich indywidualny wkład i wzajemne relacje pozostawały niewyjaśnione. Czy działają jako monomery, homodimery, czy może heterodimeryczne kompleksy? I czy wszystkie cztery białka posiadają aktywność katalityczną?
Zespół naukowców z University of Copenhagen i University of Oxford przeprowadził kompleksowe badania strukturalne i funkcjonalne, łącząc koekspresję w komórkach ludzkich, analizy in silico (AlphaFold 2), kriomikroskopię elektronową (cryo-EM) oraz testy enzymatyczne in vitro i in cellulo. Wyniki opublikowano w Nature Communications.
Które kombinacje syntetaz CS faktycznie się tworzą?
Autorzy wykonali eksperymenty koekspresji w komórkach HEK293-F, HeLa i CHO, transfekując je konstruktami kodującymi skrócone formy CHSY1, CHSY3, CHPF i CHPF2 (pozbawione helisy przezbłonowej). Spośród sześciu możliwych kombinacji heterodimerycznych wykryto ekspresję białek tylko dla czterech: CHSY1-CHPF, CHSY1-CHPF2, CHSY3-CHPF i CHSY3-CHPF2. Pojedyncze transfekcje nie prowadziły do wykrycia białek, co wskazuje, że formy monomeryczne lub homodimeryczne nie są stabilne albo nie są wydzielane.
Analizy in silico z użyciem AlphaFold 2 potwierdziły te obserwacje – modele dla czterech wykrytych kompleksów uzyskały wysokie wartości ipTM (>0,9) i niskie wartości PAE, co świadczy o dużym prawdopodobieństwie ich istnienia. W przeciwieństwie do tego, modele dla par CHSY1-CHSY3 oraz CHPF-CHPF2 miały niskie ipTM (<0,4) i wysokie odległości w wykresach PAE, co sugeruje brak stabilnych interakcji. Co istotne, zawsze obserwowano parowanie jednej z syntetaz chondroityny (CHSY1 lub CHSY3) z jednym z czynników polimeryzujących (CHPF lub CHPF2), natomiast syntetazy nie tworzyły kompleksów między sobą, podobnie jak czynniki polimeryzujące.
Co ujawniła struktura kompleksu CHSY3-CHPF?
Zespół wybrał kompleks CHSY3-CHPF do szczegółowych badań strukturalnych ze względu na jego najwyższą stabilność termiczną (Tm ≈48°C) i aktywność polimeryzacyjną. Struktura została rozwiązana metodą cryo-EM przy nominalnej rozdzielczości 3,0 Å. Analiza ujawniła architekturę złożoną z czterech domen GT (glikozylotransferaz): każde białko – CHSY3 i CHPF – zawiera N-końcową domenę GT31 (z przypuszczalną aktywnością transferazy GlcA) oraz C-końcową domenę GT7 (z przypuszczalną aktywnością transferazy GalNAc).
Model eksperymentalny doskonale koreluje z przewidywaniem AlphaFold 2 (RMSD 1,080 Å dla 522 par atomów Cα). CHSY3 i CHPF tworzą ściśle upakowany kompleks z całkowitą powierzchnią interakcji wynoszącą 6711 Ų. Kluczowym elementem stabilizującym jest obecność długiej helisy typu coiled-coil oraz tzw. domeny środkowej, która powstaje poprzez wymianę nici β między CHSY3 a CHPF. Ta domena środkowa jest unikalna wśród struktur GT, z wyjątkiem transferaz GalNAc CSGALNACT1 i CSGALNACT2.
W centrum aktywnym N-końcowej domeny GT31 CHSY3 zidentyfikowano cząsteczkę UDP (produkt reakcji transferazy) oraz jon Mn²⁺. Kluczowe reszty zaangażowane w wiązanie UDP to: motyw DxD (D261 i D263), który wraz z H394 koordynuje jon metalu, oraz D231, K238, D262, R187, Y233 i K397, stabilizujące różne fragmenty UDP. Co istotne, te reszty są zachowane w CHSY1 i CHSY3, ale nieobecne w CHPF i CHPF2, co sugeruje, że tylko CHSY1 i CHSY3 posiadają aktywność katalityczną.
Jak przebiega wydłużanie łańcucha chondroityny?
Aby zidentyfikować reszty katalityczne w C-końcowej domenie GT7, autorzy porównali strukturę CHSY3-CHPF z polimerą chondroityny z Escherichia coli K4 (PDB: 2Z87), która była skrystalizowana w kompleksie z UDP-GalNAc i jonem Mn²⁺. Dzięki temu zidentyfikowano kluczowe reszty w domenie GT7 CHSY3: motyw DxD (D718 i D720), a także P626, R630, R697, E806, D807, H831 i H834. Podobnie jak w domenie GT31, te reszty są zachowane w CHSY1 i CHSY3, ale nie w CHPF i CHPF2.
W celu eksperymentalnej weryfikacji roli poszczególnych centrów aktywnych zespół stworzył mutanty punktowe CHSY3 w kompleksie z dzikim typem CHPF. Mutacje w domenie N-końcowej (D261N/D263N, H394A) całkowicie zniosły aktywność transferazy GlcA, podczas gdy mutacje w domenie C-końcowej (D718N/D720N, H831A) blokowały transfer GalNAc. Mimo obecności CHPF w postaci dzikiego typu, kompleksy mutantowe nie były w stanie katalizować wydłużania łańcucha, co potwierdza, że tylko CHSY1 i CHSY3 posiadają aktywność enzymatyczną, a CHPF i CHPF2 pełnią rolę strukturalną niezbędną dla stabilności i aktywności kompleksu.
Jak kompleksy CS polimerazy działają w komórkach?
Autorzy opracowali test komplementacji in cellulo, wykorzystując linię komórkową HEK293-6E z podwójnym nokautem CHSY1/CHSY3. Komórki te niemal całkowicie utraciły zdolność biosyntezy CS. Transfekcja plazmidów kodujących pełnowymiarowe CHSY1 lub CHSY3 wraz z CHPF przywracała poziom CS odpowiednio do około 80% i 40% w porównaniu z komórkami dzikiego typu.
Natomiast transfekcja mutantów CHSY1 lub CHSY3 (z mutacjami w domenie GlcA-T lub GalNAc-T) przy zachowaniu CHPF w postaci dzikiego typu nie przywracała biosyntezy CS. To potwierdza, że obie aktywności – transferazy GlcA i transferazy GalNAc – są niezbędne dla biosyntezy CS w komórkach. Ponadto podwójna delecja CHPF/CHPF2 w komórkach HEK293 prowadziła do całkowitego braku wykrycia CS na powierzchni komórek, co dodatkowo wspiera hipotezę, że obecność CHPF lub CHPF2 jest konieczna do utworzenia stabilnych i funkcjonalnych kompleksów polimerazy CS.
Eksperymenty in vitro z oczyszczonymi kompleksami wykazały, że wszystkie cztery heterodimeryczne kompleksy są zdolne do wydłużania łańcuchów CS. Kompleksy CHSY1-CHPF, CHSY1-CHPF2 i CHSY3-CHPF generowały łańcuchy o masie cząsteczkowej około 137–151 kDa (odpowiadające 800 lub więcej jednostkom glikanu), natomiast CHSY3-CHPF2 produkował krótsze łańcuchy o masie około 43 kDa. Różnice te mogą mieć znaczenie biologiczne, choć mogą również wynikać z różnic w stabilności termicznej kompleksów lub warunków oczyszczania.
Dlaczego to odkrycie ma znaczenie dla medycyny?
Biosynteza chondroityny jest kluczowa w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych. Defekty w tej ścieżce są związane z osteoartrozą, stanami zapalnymi, infekcjami oraz różnymi nowotworami. Dotychczas brak było jasnego modelu funkcjonalnej jednostki polimerazy CS, co utrudniało rozwój terapii celowanych.
Odkrycie, że tylko CHSY1 i CHSY3 posiadają aktywność katalityczną, podczas gdy CHPF i CHPF2 są niezbędne dla stabilności kompleksu, pozwala na precyzyjne targetowanie specyficznych kompleksów w terapii. Na przykład mutacja D633N w CHSY1, zidentyfikowana u pacjenta z zespołem brachydaktyly Temtamy’ego, została potwierdzona jako krytyczna dla biosyntezy CS w testach in cellulo. To podkreśla kliniczne znaczenie zrozumienia struktury i funkcji kompleksów CS polimerazy.
Ponadto istnienie czterech różnych kompleksów heterodimerycznych może umożliwiać różnicową regulację biosyntezy CS w zależności od typu tkanki. Na przykład CHSY1 jest szeroko ekspresjonowany w różnych tkankach, podczas gdy CHSY3 jest bardziej specyficzny dla komórek neuronalnych i glejowych. Możliwe jest również, że różne kompleksy produkują łańcuchy CS o różnej długości lub wzorach sulfatacji, co może wpływać na ich interakcje z innymi enzymami biosyntezy CS, takimi jak chondroitin 4-O-sulfotransferaza-1, która reguluje długość łańcucha.
Jakie pytania pozostają bez odpowiedzi?
Mimo zaawansowanych technik badawczych pozostaje kilka istotnych pytań. Po pierwsze, badania in cellulo prowadzone były w hodowlanych liniach komórkowych, co może nie w pełni odzwierciedlać złożoności organizmu wielokomórkowego. Po drugie, różnice w długościach łańcuchów CS między kompleksami mogą wynikać z warunków oczyszczania i stabilności kompleksów, a nie z rzeczywistych różnic biologicznych.
Autorzy nie zaobserwowali w strukturze cryo-EM gęstości dla oktasacharydu (substratu akceptorowego), który był dodawany podczas przygotowania próbki. Przyszłe badania strukturalne z substratami akceptorowymi o różnej długości mogłyby ujawnić mechanizm wiązania substratu oraz rolę elastycznych helis C-końcowych, które nie były widoczne w obecnej strukturze. Ponadto rola domeny środkowej pozostaje zagadką – może ona promować interakcje białko-białko z innymi enzymami biosyntezy CS lub substratami CSPG.
Wreszcie odległość między centrami aktywnymi (około 60 Å) sugeruje, że wydłużanie łańcucha przebiega w mechanizmie dystrybucyjnym (łańcuch odłącza się od kompleksu przed kolejnym cyklem katalitycznym), a nie procesywnym. Potwierdzają to eksperymenty rescue, w których mieszanina mutantów deficytowych w GlcA-T i GalNAc-T przywracała polimeryzację do poziomu dzikiego typu. Jednak szczegółowe badania kinetyczne są konieczne, aby w pełni scharakteryzować mechanizm reakcji.
Co to odkrycie zmienia w naszym rozumieniu biosyntezy CS?
Badanie to dostarcza pierwszego kompleksowego modelu strukturalnego i funkcjonalnego ludzkiej polimerazy chondroityny. Autorzy wykazali, że funkcjonalne jednostki to cztery heterodimeryczne kompleksy – CHSY1-CHPF, CHSY1-CHPF2, CHSY3-CHPF i CHSY3-CHPF2 – w których katalityczną aktywność wykazują wyłącznie CHSY1 i CHSY3, podczas gdy CHPF i CHPF2 są niezbędne dla stabilności kompleksu. Struktura cryo-EM kompleksu CHSY3-CHPF przy rozdzielczości 3,0 Å ujawniła powierzchnię interakcji wynoszącą 6711 Ų oraz szczegóły centrów aktywnych odpowiedzialnych za transfer GlcA i GalNAc. Odkrycie to otwiera drogę do celowanej terapii w chorobach, w których biosynteza CS odgrywa kluczową rolę, takich jak osteoartroza, stany zapalne i nowotwory. Możliwość monitorowania specyficznych mutacji (np. D633N w CHSY1) może wspierać diagnostykę i kierowanie leczeniem. Przyszłe badania powinny skupić się na kinetyce reakcji, interakcjach z innymi enzymami biosyntezy CS oraz różnicach w produktach generowanych przez różne kompleksy.
Pytania i odpowiedzi
❓ Które enzymy syntetazy chondroityny faktycznie katalizują reakcje biosyntezy CS?
Tylko CHSY1 i CHSY3 posiadają aktywność katalityczną – zarówno transferazy GlcA (domena N-końcowa), jak i transferazy GalNAc (domena C-końcowa). CHPF i CHPF2 nie wykazują aktywności enzymatycznej, ale są niezbędne do stabilizacji heterodimerycznych kompleksów polimerazy CS. Mutacje w kluczowych resztach katalitycznych CHSY1 lub CHSY3 całkowicie znoszą biosyntezę CS zarówno in vitro, jak i w komórkach.
❓ Jakie kompleksy polimerazy CS tworzą się w ludzkich komórkach?
W komórkach ludzkich tworzą się cztery heterodimeryczne kompleksy: CHSY1-CHPF, CHSY1-CHPF2, CHSY3-CHPF i CHSY3-CHPF2. Nie obserwuje się tworzenia kompleksów CHSY1-CHSY3 ani CHPF-CHPF2. Zawsze występuje parowanie jednej syntetazy (CHSY1 lub CHSY3) z jednym czynnikiem polimeryzującym (CHPF lub CHPF2). Podwójna delecja genów CHSY1/CHSY3 lub CHPF/CHPF2 całkowicie znosi biosyntezę CS.
❓ Jakie jony metali są niezbędne do aktywności kompleksów CS polimerazy?
Aktywność transferazy GlcA i GalNAc jest zależna od obecności jonów metali dwuwartościowych. Najwyższą aktywność katalityczną obserwuje się w obecności Mn²⁺, pośrednią dla Mg²⁺ i Ca²⁺. Jon Mn²⁺ jest koordynowany przez motyw DxD (D261 i D263 w CHSY3) oraz resztę histydyny (H394). Struktura cryo-EM potwierdza obecność Mn²⁺ w centrach aktywnych obu domen GT.
❓ Czy różne kompleksy CS polimerazy produkują łańcuchy o różnej długości?
Badania in vitro wskazują, że kompleksy CHSY1-CHPF, CHSY1-CHPF2 i CHSY3-CHPF generują łańcuchy CS o masie cząsteczkowej około 137–151 kDa (800 lub więcej jednostek glikanu), natomiast CHSY3-CHPF2 produkuje krótsze łańcuchy o masie około 43 kDa. Nie jest jeszcze jasne, czy różnice te mają znaczenie biologiczne, czy wynikają z warunków eksperymentalnych. Wymaga to dalszych badań kinetycznych i analiz in vivo.
❓ Jakie są potencjalne zastosowania kliniczne tego odkrycia?
Zrozumienie struktury i funkcji kompleksów CS polimerazy otwiera drogę do celowanej terapii w osteoartrozie, stanach zapalnych i nowotworach. Mutacja D633N w CHSY1, zidentyfikowana u pacjenta z zespołem brachydaktyly Temtamy’ego, została potwierdzona jako krytyczna dla biosyntezy CS. Możliwość targetowania specyficznych kompleksów oraz monitorowania patogennych mutacji może wspierać diagnostykę i personalizację leczenia w chorobach związanych z defektami biosyntezy chondroityny.
