CSPG4 w HCC: nowy biomarker prognostyczny lepszy niż TNM

Czy CSPG4 może wypełnić lukę w prognozowaniu HCC?

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) pozostaje jednym z najczęstszych nowotworów złośliwych na świecie – w 2020 roku odnotowano 905 677 nowych przypadków i 830 180 zgonów. Mimo postępów w chirurgii i terapiach celowanych, 5-letnie przeżycie osiąga zaledwie 18% pacjentów, a częstość nawrotów po operacji pozostaje wysoka. Kluczowym problemem jest heterogeniczność HCC i brak wiarygodnych biomarkerów molekularnych do wczesnej diagnostyki i oceny rokowania.

Obecne narzędzia prognostyczne mają istotne ograniczenia. Alfa-fetoproteina (AFP), najszerzej stosowany marker, wykazuje niewystarczającą czułość w około 40% przypadków, szczególnie we wczesnych stadiach HCC, i nie pozwala na stratyfikację ryzyka u pacjentów AFP-negatywnych. Klasyfikacja TNM, choć stanowi standard kliniczny, często nie odzwierciedla heterogeniczności w grupach pośredniego ryzyka, prowadząc do nieptymalnej kwalifikacji do leczenia. Te ograniczenia podkreślają pilną potrzebę nowych biomarkerów zwiększających dokładność prognostyczną i umożliwiających spersonalizowane podejście terapeutyczne.

Proteoglikan siarczanu chondroityny 4 (CSPG4), znany również jako Neural/Glial Antigen 2, to białko powierzchniowe komórkowe odgrywające kluczowe role w proliferacji, migracji komórek i angiogenezie. Podwyższone poziomy CSPG4 wykryto w różnych nowotworach złośliwych – czerniaku skóry, glejakach mózgu czy hormonoopornych rakach piersi – gdzie wyższa ekspresja wiąże się z niekorzystnym rokowaniem i zwiększonym ryzykiem przerzutów. W czerniaku CSPG4 służy jako narzędzie diagnostyczne i prognostyczne, a także jako obiecujący cel terapeutyczny. Mechanistycznie CSPG4 promuje progresję nowotworu poprzez aktywację szlaków zależnych od integryn, wzmocnienie sygnalizacji czynników wzrostu i modulację macierzy zewnątrzkomórkowej. Pomimo istotnej roli w innych nowotworach, funkcje biologiczne i potencjalne znaczenie kliniczne CSPG4 w HCC pozostają w dużej mierze niezbadane.

Jakie pytania postawili autorzy?

W odpowiedzi na te wyzwania naukowcy zbadali kliniczne znaczenie i mechanistyczną rolę CSPG4 w HCC. Wykorzystując publiczne bazy danych, dwie niezależne grupy pacjentów oraz eksperymenty in vitro, postawili sobie za cel wyjaśnienie związku CSPG4 z cechami kliniczno-patologicznymi, walidację jego wartości prognostycznej oraz zbadanie potencjału jako elementu wieloparametrowego modelu prognostycznego.

Badanie objęło analizę ekspresji genu CSPG4 w bazie TCGA (371 próbek HCC i 50 tkanek przylegających), a także ocenę immunohistochemiczną białka CSPG4 w dwóch niezależnych grupach klinicznych: 153 pacjentów z Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital (grupa treningowa, lata 2013-2016) oraz 112 pacjentów z Changhai Hospital (grupa walidacyjna, lata 2017-2021). Wszyscy pacjenci przeszli resekcję R0 (całkowite usunięcie guza z mikroskopowo czystymi marginesami), a diagnozę HCC potwierdzono histopatologicznie. Zebrano kompleksowe dane kliniczne, w tym wiek, płeć, poziomy AFP, wielkość guza, obecność inwazji mikronaczyniowej (MVI), stopień zróżnicowania guza i stadium TNM.

Czy CSPG4 jest rzeczywiście nadekspresjonowany w HCC?

Analiza danych TCGA wykazała istotnie podwyższone poziomy transkryptu CSPG4 w próbkach HCC (n = 371) w porównaniu z tkankami przynowotworzowymi (n = 50). Ten wzorzec ekspresji różnicowej potwierdzono także w 50 sparowanych parach guz-tkanka przyległa. Barwienie immunohistochemiczne CSPG4 na mikromatrycach tkankowych (TMA) z dwóch niezależnych grup HCC zwalidowało te odkrycia na poziomie białkowym – poziomy białka CSPG4 były znacząco podwyższone w większości przypadków HCC w porównaniu z odpowiadającymi tkankami wątroby przylegającej do guza.

Wykorzystując analizę time-dependent ROC na podstawie H-score z barwienia IHC w grupie treningowej, ustalono optymalny próg ekspresji CSPG4 dla przewidywania 5-letniego OS na poziomie 100 (H-score), uzyskując AUC = 0,745. Na podstawie tego punktu odcięcia pacjentów w obu grupach podzielono na kategorie CSPG4-wysokie i CSPG4-niskie. Grupa CSPG4-wysoka wykazywała bardziej agresywne cechy choroby, w tym zaawansowane stadium guza, większe wymiary guza, podwyższone poziomy AFP w surowicy i wyższą częstość występowania MVI.

Jak wyciszenie CSPG4 wpływa na komórki HCC?

Aby wyjaśnić potencjalne funkcje biologiczne CSPG4 w HCC, przeprowadzono wyciszenie CSPG4 w liniach komórkowych HCC przy użyciu technologii siRNA. Analiza Western blot potwierdziła skuteczność wyciszenia CSPG4 w komórkach Huh-7 i HCCLM3 po transfekcji siRNA. Kolejne testy proliferacji z wykorzystaniem metody CCK8 wykazały, że supresja CSPG4 znacząco osłabiła tempo wzrostu obu linii komórkowych w porównaniu z kontrolami leczonymi niecelującym siRNA (si-NC).

Odwrotnie, leczenie rekombinowanym białkiem rCSPG4 promowało proliferację komórek w sposób zależny od dawki, z maksymalnymi efektami obserwowanymi przy stężeniu 100 ng/ml, co dodatkowo potwierdza rolę CSPG4 w promowaniu proliferacji komórek HCC. Testy gojenia ran wykazały, że wyciszenie CSPG4 znacząco zmniejszyło zdolność zamykania ran zarówno w komórkach Huh-7, jak i HCCLM3 w porównaniu z grupami kontrolnymi po 48 godzinach. Dodatkowo testy migracji i inwazji ujawniły, że interferencja CSPG4 hamowała zdolności migracyjne i inwazyjne komórek HCC (p < 0,05 do p < 0,001 w zależności od testu).

Czy wysoka ekspresja CSPG4 wiąże się z gorszym rokowaniem?

Analiza przeżycia metodą Kaplana-Meiera wykazała, że pacjenci z wysoką ekspresją CSPG4 mieli istotnie gorsze OS (p < 0,001) i PFS (p < 0,001) w porównaniu z grupą CSPG4-niską. Ten trend był konsekwentny zarówno w grupie treningowej, jak i walidacyjnej. Aby dodatkowo potwierdzić wartość prognostyczną CSPG4 w HCC, przeanalizowano dane z publicznej bazy TCGA. Analiza ujawniła silną korelację między podwyższonymi poziomami CSPG4 a obniżonymi wynikami pacjentów, w tym OS, DSS (disease-specific survival) i PFS.

Kompleksowa analiza statystyczna w grupie treningowej, obejmująca analizy jedno- i wieloczynnikowe, wykazała, że ekspresja CSPG4, wielkość guza i MVI są niezależnymi wskaźnikami niekorzystnego pooperacyjnego OS i PFS. W analizie wieloczynnikowej CSPG4 wykazała HR = 2,577 (95% CI: 1,564-4,246; p < 0,001) dla OS oraz HR = 2,021 (95% CI: 1,294-3,156; p = 0,002) dla PFS. Grupa walidacyjna potwierdziła te odkrycia.

Czy integracja CSPG4 z parametrami klinicznymi poprawia prognozowanie?

Następnie oceniono dokładność predykcyjną tych czynników zarówno indywidualnie, jak i w kombinacji poprzez analizę C-index w grupie treningowej. Kombinacja CSPG4, wielkości guza i MVI wykazała najwyższą skuteczność predykcyjną zarówno dla OS, jak i PFS. Wartości C-index dla tego panelu były istotnie wyższe niż dla pojedynczych czynników lub innych kombinacji – dla OS osiągnięto C-index = 0,811 (95% CI: 0,742-0,881), a dla PFS C-index = 0,822 (95% CI: 0,751-0,893). Te odkrycia zostały dodatkowo potwierdzone w grupie walidacyjnej.

Zdolności predykcyjne nowego modelu opartego na CSPG4 oceniono w porównaniu z szeroko stosowanymi metodologiami klasyfikacji – systemami TNM i Child-Pugh. Moc dyskryminacyjna modelu dla przewidywania przeżycia została oceniona przy użyciu krzywych ROC, z wartościami AUC wykazującymi lepszą wydajność w obu grupach w porównaniu z konwencjonalnymi klasyfikacjami dla OS i PFS (p < 0,001). Biorąc pod uwagę, że około 30% przypadków HCC to przypadki AFP-negatywne, przeprowadzono ukierunkowaną analizę tej podgrupy. W 64 przypadkach HCC AFP-negatywnych (≤20 ng/ml) podwyższona ekspresja CSPG4 korelowała z wyraźnie gorszymi wynikami OS i PFS.

Jakie mechanizmy mogą wyjaśniać rolę CSPG4 w HCC?

Chociaż bezpośrednie badania nad CSPG4 w HCC są ograniczone, badania nad innymi nowotworami dostarczają wglądu w potencjalne mechanizmy i wspierają związek między nadekspresją CSPG4 a złym rokowaniem obserwowanym w tym badaniu. CSPG4 moduluje szlaki sygnalizacyjne integryn i czynników wzrostu, promując proliferację komórek nowotworowych, inwazję i oporność na apoptozę. W glejakowatości mózgu CSPG4 aktywuje oś Akt-ERK i reguluje transkrypcję mediowaną przez EGR1, utrzymując przeżycie nowotworu i chemooporność. W komórkach macierzystych glejaka CSPG4 wiąże się z integryną αV, aktywując szlak integryna-ERK w celu utrzymania właściwości macierzystych i inwazyjności komórek.

Zbiorczo CSPG4 funkcjonuje jako wielofunkcyjny koreceptor, napędzając progresję nowotworu poprzez aktywację ERK zależną od integryn oraz interakcje z receptorami czynników wzrostu, takimi jak PDGFR, VEGFR i IGF. Biorąc pod uwagę role sygnalizacji integryn i szlaków czynników wzrostu w HCC, CSPG4 prawdopodobnie promuje inwazję guza i angiogenezę, przyczyniając się do niekorzystnych wyników pacjentów. Przyszłe badania powinny zbadać te mechanizmy w HCC, szczególnie interakcje CSPG4 z kluczowymi szlakami, takimi jak FAK/ERK i EGFR/MET.

Co to oznacza dla praktyki klinicznej w HCC?

Badanie po raz pierwszy ujawnia kluczową rolę CSPG4 w raku wątrobowokomórkowym, wykazując jego znaczący potencjał zarówno jako cennego biomarkera prognostycznego, jak i obiecującego celu terapeutycznego. Kombinacja CSPG4 z istniejącymi parametrami klinicznymi istotnie poprawia dokładność przewidywania rokowania, dostarczając nowych informacji dla indywidualizowanych decyzji terapeutycznych. Model prognostyczny osiągający C-index 0,811 przewyższa tradycyjne systemy klasyfikacji i zachowuje wartość u pacjentów AFP-negatywnych, u których standardowe markery zawodzą.

Kluczowym ograniczeniem jest zawężenie grup badanych tylko do pacjentów z resekcyjnym HCC leczonych w dwóch chińskich ośrodkach, głównie z HCC związanym z HBV, co ogranicza możliwość uogólnienia wyników na zaawansowane HCC i etiologie inne niż HBV. Potrzebne są wieloośrodkowe badania prospektywne obejmujące międzynarodowe grupy pacjentów o różnych etiologiach. Dodatkowo brak modeli in vivo uniemożliwia pełne wyjaśnienie rozbieżności między zachowaniem komórek in vitro a biologią in vivo, szczególnie wpływem mikrośrodowiska guza na funkcję CSPG4.

Mimo że dalsze badania są potrzebne do wyjaśnienia szczegółowych mechanizmów i zastosowań klinicznych, CSPG4 niewątpliwie może przyczynić się do postępu zarówno w ocenie prognostycznej, jak i strategiach terapeutycznych w HCC. Integracja biomarkerów molekularnych z parametrami klinicznymi reprezentuje przyszłość precyzyjnej medycyny w onkologii hepatologicznej.