Chondroityna siarczanowa w regeneracji chrząstki – mechanizmy działania

Chondroityna siarczanowa – jakie mechanizmy regeneracji kryją się w jej działaniu?

Chondroityna siarczanowa stymuluje regenerację chrząstki poprzez złożone mechanizmy molekularne

Osteoartroza (OA) stanowi jedną z najczęstszych chorób zwyrodnieniowych stawów na świecie, a dostępne terapie koncentrują się głównie na odbudowie chrząstki i macierzy pozakomórkowej (ECM) w celu zmniejszenia bólu – głównego objawu stanu zapalnego. Choroba charakteryzuje się nieprawidłową syntezą macierzy chrząstki stawowej, postępującą hipokomórkowością, degradacją i fragmentacją chrząstki stawowej, rozwojem nowej kości okołostawowej, zwiększoną gęstością kości podchrzęstnej oraz zmiennym stanem zapalnym błony maziowej. Coraz więcej dowodów wskazuje, że metaloproteinazy macierzy (MMPs) odgrywają kluczową rolę w degradacji chrząstki, rozkładając ECM. Różne szlaki, w tym MAPK, NF-κB i PI3K/Akt, promują ekspresję MMPs podczas procesu OA. Chondroityna siarczanowa (CS), naturalny biomakrocząsteczka występująca powszechnie u kręgowców, w tym ludzi, może stanowić obiecującą opcję terapeutyczną, jednak dokładne mechanizmy molekularne jej działania nie były dotąd w pełni poznane.

Zespół badaczy postanowił zgłębić ten temat, badając wpływ chondroityny na linię komórkową chondrocytów chon-001. “Chondroityna siarczanowa i kwas hialuronowy są podstawowymi składnikami aggrecanu tworzonego w chrząstce stawowej. W przebiegu choroby zwyrodnieniowej stawów lub osteoartrozy synteza aggrecanu jest zmniejszona, co prowadzi do utraty sprężystości chrząstki, bólu i innych objawów towarzyszących OA” – wyjaśniają autorzy badania. CS należy do glikozaminoglikanów i oferuje wiele specyficznych funkcji biologicznych na poziomie molekularnym, komórkowym i narządowym, takich jak podział komórek, adhezja i różnicowanie komórek, organogeneza, morfogeneza i tworzenie sieci neuronalnych.

W przeprowadzonym eksperymencie naukowcy oceniali wpływ różnych stężeń CS na proliferację i migrację chondrocytów, ekspresję ECM oraz powiązane szlaki sygnałowe. Dodatkowo zbadano, czy wewnątrzkomórkowa produkcja reaktywnych form tlenu (ROS) stanowi kluczowy element indukujący migrację chondrocytów. Badacze wykorzystali linię komórkową chondrocytów chon-001 pozyskaną z American Type Culture Collection (ATCC). Komórki traktowano różnymi stężeniami CS (0, 100, 200, 400, 800 lub 1600 μg/ml) przez 48 lub 72 godziny, a następnie przeprowadzono szereg testów, w tym badanie żywotności komórek, test migracji, Western blotting, zymografię żelatynową oraz oznaczenie wewnątrzkomórkowego ROS.

Czy CS moduluje ekspresję enzymów i sygnałów w chondrocytach?

Wyniki badania wskazują, że CS w stężeniach 100-200 μg/ml znacząco stymuluje proliferację komórek po 48 i 72 godzinach ekspozycji. Co więcej, zaobserwowano zwiększoną migrację komórek po zastosowaniu CS w stężeniu 200 μg/ml przez 72 godziny. Interesujące jest to, że CS indukuje przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) w chondrocytach, co objawia się zwiększoną ekspresją wimentyny (marker mezenchymalny) i zmniejszoną ekspresją E-kadheryny (marker nabłonkowy).

Naukowcy odkryli również, że CS zwiększa ekspresję tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1 i TIMP-2), które są endogennymi modulatorami MMPs. “TIMPs są endogennymi modulatorami białkowymi rodziny metaloproteinaz macierzy” – podkreślają badacze. Równowaga między MMPs a ich inhibitorami jest kluczowa dla homeostazy tkanki chrzęstnej. Ekspresja TIMP-1 i TIMP-2 była zwiększona przez CS (100 i 200 μg/ml) po 48 godzinach leczenia. Ponadto ekspresja TIMP-1 była zwiększona przez CS (200 μg/ml) po 72 godzinach.

Analizując mechanizmy molekularne, zespół badawczy wykazał, że CS hamuje szlak Akt/IKK/NF-κB w chondrocytach. Fosforylacja Akt, IKK, IκB i p65 została zmniejszona po zastosowaniu CS w stężeniach 100 i 200 μg/ml. “Ekspresja MMPs jest regulowana przez szlak Akt/IKK/NF-κB” – zauważają autorzy. Inhibicja tego szlaku przyczynia się do zmniejszenia ekspresji i aktywności MMPs, co może chronić chrząstkę przed degradacją. Badacze wykazali, że stała aktywacja NF-κB w chondrocytach stymuluje i zwiększa transkrypcję metaloproteinaz. Wcześniejsze badania wskazują również, że dafnetyna, tradycyjny lek chiński, hamuje ekspresję MMP-9 indukowaną przez IL-1β w chondrocytach królika. Hamujący wpływ dafnetyny na MMP-9 jest częściowo kontrolowany przez inhibicję szlaków sygnałowych PI3K/AKT i NF-κB.

Czy β-katenina jest kluczowym mediatorem proliferacji chondrocytów?

Jakie czynniki są kluczowe dla proliferacji i migracji chondrocytów indukowanych przez CS? Badanie wykazało, że ekspresja β-kateniny jest krytycznym czynnikiem dla CS wskazującym na proliferację chondrocytów. Preinkubacja z XAV939, inhibitorem β-kateniny, znacząco zmniejszyła żywotność komórek traktowanych CS, co wskazuje, że indukowana przez CS ekspresja β-kateniny jest kluczowym czynnikiem dla proliferacji chondrocytów.

Co więcej, CS indukuje wewnątrzkomórkowe ROS, które promują migrację chondrocytów. Zastosowanie przeciwutleniacza propylgallatu (PG) znacząco zmniejszyło wewnątrzkomórkowe ROS indukowane przez CS, a także zahamowało migrację komórek indukowaną przez CS. Reaktywne formy tlenu (ROS) w fizjologicznych stężeniach działają jako wewnątrzkomórkowe sygnały w chondrocytach i są niezbędne dla wczesnego różnicowania chondrogenetycznego.

Warto podkreślić, że stężenia CS stosowane w badaniach in vitro (100-200 μg/ml) były zbliżone do stężeń osiąganych miejscowo w stawie kolanowym u pacjentów leczonych CS. “Objętość płynu maziowego ludzkiego stawu kolanowego w warunkach patologicznych może przekraczać 100 ml. Inne doniesienia wskazują, że dostawowe wstrzyknięcia 2 ml Arthrum HCS zawierającego 40 mg kwasu hialuronowego i 40 mg CS u pacjentów z OA kolana są bezpieczne i skuteczne” – wyjaśniają badacze. Stężenie CS w stawie kolanowym w warunkach patologicznych po wstrzyknięciu Arthrum HCS będzie niższe niż 400 μg/ml, co potwierdza, że dawki stosowane w badaniach in vitro (100-200 μg/ml) były zbliżone do dawek osiąganych miejscowo u pacjentów leczonych CS.

Szlak β-kateniny odgrywa istotną rolę w regulacji chondrocytów podczas różnych etapów rozwoju chrząstki. Sygnał β-kateniny pochodzący z chrząstki jest dominującym mediatorem głównych wydarzeń podczas endochondralnego tworzenia kości, w tym dojrzewania chondrocytów. W obecnym badaniu wyniki Western blot wykazały znaczący wzrost ekspresji β-kateniny w chondrocytach chon-001 traktowanych CS.

Interesujące jest, że preinkubacja z XAV939 znacząco hamowała proliferację komórek indukowaną przez CS po 48 i 72 godzinach. XAV939 może hamować translokację β-kateniny do jądra komórkowego i blokować aktywność transkrypcji. “Uzyskany przez nas wynik koreluje z wcześniejszym doniesieniem, które wskazuje na wpływ glukozaminy na proliferację chondrocytów wyizolowanych z chrząstki kolanowej szczurów Sprague Dawley. Leczenie glukozaminą znacząco zwiększyło proliferację chondrocytów związaną z ekspresją białek regulujących cykl komórkowy” – podkreślają autorzy badania.

Czy reaktywne formy tlenu (ROS) wspierają regenerację chrząstki?

Czy reaktywne formy tlenu (ROS) mogą odgrywać pozytywną rolę w procesach regeneracyjnych chrząstki? Wbrew powszechnym przekonaniom o wyłącznie szkodliwym działaniu ROS, badacze wykazali, że fizjologiczne poziomy ROS pełnią funkcję wewnątrzkomórkowych sygnałów w chondrocytach. Chondrogeneza to dynamiczny i precyzyjnie regulowany proces, obejmujący różne etapy różnicowania chondrocytów, takie jak kondensacja mezenchymalnych komórek progenitorowych, rozwój chrząstki, proliferacja chondrocytów i hipertroficzne różnicowanie chondrocytów.

Badacze podkreślają, że ROS wytwarzane przez oksydazy NADPH są niezbędne dla wczesnego różnicowania chondrogenetycznego. W przeprowadzonym badaniu wykazano, że wzrost migracji pod wpływem CS zwiększał poziom ROS w komórkach chon-001. Zidentyfikowano również, że PG, antyoksydant polifenolowy, zapobiegał migracji indukowanej przez CS. “Wyniki te wskazują, że CS wywiera wpływ na migrację komórek chon-001, przynajmniej częściowo poprzez produkcję wewnątrzkomórkowego ROS” – konkludują naukowcy.

Czy CS wpływa na przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) w chondrocytach?

Warto również zwrócić uwagę na wpływ CS na przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) w chondrocytach. W badaniu wykazano, że CS zwiększało ekspresję wimentyny, markera mezenchymalnego, i zmniejszało ekspresję E-kadheryny, markera nabłonkowego. Przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) to proces, w którym komórki nabłonkowe tracą swoje cechy charakterystyczne i nabywają właściwości komórek mezenchymalnych, co zwiększa ich zdolność do migracji i inwazji.

Badacze zidentyfikowali trzy procesy transformacji morfologicznej chondrocytów w płytce wzrostowej. W strefie spoczynkowej istnieje skupisko komórek macierzystych podobnych do nabłonka. W strefie proliferacyjnej znajdują się komórki wrzecionowate. W strefie hipertroficznej umieszczone są kolumnowe i ściśle przylegające chondrocyty. “Strefa proliferacyjna pełni istotną funkcję podczas endochondralnego tworzenia kości; jest to również obszar aktywnej reprodukcji komórek” – wyjaśniają autorzy.

Zhou i współpracownicy (2015) wykazali, że chondrocyty wykazywały wysoką ekspresję biomarkerów mezenchymalnych i utratę markerów powierzchniowych nabłonka w strefie proliferacji płytki wzrostowej w dystalnej kości piszczelowej myszy in vivo. “Dlatego ważne było zbadanie, czy CS pośredniczy w swoim ochronnym działaniu na chrząstkę poprzez regulację EMT i utrzymanie chondrocytów w stanie podobnym do strefy proliferacyjnej” – podkreślają badacze.

Jakie nowe możliwości terapeutyczne oferuje CS?

Jakie są potencjalne implikacje kliniczne tych odkryć? Wyniki badania sugerują, że CS może być obiecującym środkiem terapeutycznym w leczeniu chorób zwyrodnieniowych stawów. Poprzez stymulację proliferacji i migracji chondrocytów, zwiększenie ekspresji kolagenu typu II oraz hamowanie aktywności enzymów degradujących macierz, CS może przyczyniać się do regeneracji uszkodzonej chrząstki stawowej.

CS hamuje zewnątrzkomórkowe proteazy zaangażowane w metabolizm tkanek łącznych i może przyspieszać produkcję proteoglikanów przez chondrocyty oraz zmniejszać wytwarzanie cytokin chrząstki. Ponadto CS zwiększa wewnętrzną lepkość płynu maziowego. W kościach CS przyspiesza mineralizację i gojenie.

Podsumowując, badanie dostarcza dowodów na korzystne działanie CS na ludzką chrząstkę poprzez indukcję proliferacji. W szczególności CS hamowało poziomy ekspresji i aktywności MMP-2/9 poprzez inhibicję szlaku sygnałowego PI3K/Akt/NF-κB. W obecnym badaniu indukowana przez CS proliferacja i migracja są mediowane odpowiednio przez ekspresję β-kateniny i wewnątrzkomórkowy ROS. “Dlatego CS jest potencjalnym lekiem ochronnym do utrzymania zdrowej chrząstki” – konkludują badacze.

Zrozumienie molekularnych mechanizmów działania chondroityny siarczanowej otwiera nowe możliwości terapeutyczne w leczeniu osteoartrozy i innych chorób zwyrodnieniowych stawów. Modulacja szlaków sygnałowych, takich jak PI3K/Akt/NF-κB i β-katenina, może stanowić obiecującą strategię w opracowywaniu nowych terapii celowanych. Dalsze badania kliniczne są potrzebne, aby w pełni ocenić skuteczność i bezpieczeństwo stosowania CS u pacjentów z chorobami zwyrodnieniowymi stawów.

Podsumowanie

Badania nad chondroityną siarczanową (CS) wykazały jej złożony mechanizm działania w regeneracji chrząstki stawowej. CS w stężeniach 100-200 μg/ml stymuluje proliferację i migrację chondrocytów poprzez modulację ekspresji β-kateniny oraz indukcję wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS). Substancja ta hamuje szlak Akt/IKK/NF-κB w chondrocytach, co prowadzi do zmniejszenia ekspresji metaloproteinaz macierzy (MMPs) i zwiększenia ekspresji ich inhibitorów (TIMP-1 i TIMP-2). CS wpływa również na przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) w chondrocytach, zwiększając ekspresję markerów mezenchymalnych i zmniejszając ekspresję markerów nabłonkowych. Wykazane mechanizmy molekularne potwierdzają potencjał terapeutyczny CS w leczeniu chorób zwyrodnieniowych stawów, szczególnie osteoartrozy.