DexS jako nowy inhibitor w leczeniu urazów rdzenia kręgowego

Czy DexS otwiera nowe perspektywy w leczeniu urazów rdzenia?

Siarczan dekstranu (DexS) wykazuje silne działanie hamujące na aktywność chondroitynazy ABC (CSase ABC), kluczowego enzymu degradującego siarczan chondroityny (CS) w macierzy zewnątrzkomórkowej – wskazują najnowsze badania. To odkrycie może mieć istotne znaczenie dla potencjalnych interwencji terapeutycznych w urazach rdzenia kręgowego i innych schorzeniach, w których przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej odgrywa kluczową rolę.

Siarczan chondroityny jest powszechnie występującym glikozaminoglikanem (GAG) w proteoglikanach macierzy zewnątrzkomórkowej i okołokomórkowej. Jego struktura składa się z długich powtarzających się jednostek disacharydowych N-acetylogalaktozaminy (GalNAc) i kwasu glukuronowego (GlcA) z wiązaniem (β−1,3 GalNAc–β−1,4 GlcA)_n. Łańcuchy GAG CS mogą być sulfonowane w pozycjach 4 i 6 GalNAc lub w pozycji 2 GlcA, albo pozostać niesulfonowane. Złożoność strukturalna i różnorodna aktywność biologiczna CS wynika z różnic w stopniu i wzorcach sulfonowania w różnych długościach łańcucha. W centralnym układzie nerwowym CS pełni funkcję bariery chemicznej ograniczającej projekcje aksonalne i regenerację. Po urazie rdzenia kręgowego (SCI) dochodzi do zmian w macierzy zewnątrzkomórkowej, prowadzących do rozwoju blizny glejowej i zwiększonej ekspresji proteoglikanów siarczanu chondroityny (CSPG) o specyficznych wzorach sulfonowania. Enzymatyczna degradacja tych łańcuchów przy użyciu chondroitynaz, bakteryjnych enzymów degradujących CS, wykazała obiecujące wyniki w ułatwianiu wzrostu aksonów i jest rozważana jako potencjalna interwencja terapeutyczna w SCI.

Czy enzymatyczna degradacja odsłania potencjał DexS?

Badanie strukturalnej różnorodności łańcuchów CS wymaga zastosowania mikrobiologicznych enzymów liaz do ukierunkowanej hydrolizy, dającej disacharydy i tetrasacharydy. Hydroliza CS przy użyciu bakteryjnych liaz wykorzystuje mechanizm β-eliminacji. Mechanizm ten polega na neutralizacji ładunku grupy karboksylowej poprzez usunięcie protonu z centrum chiralnego monosacharydu kwasu glukuronowego i uwolnienie 4-połączonej heksozoaminy, tworząc jednocześnie wiązanie podwójne C4-C5 w pierścieniu kwasu glukuronowego. Kilka form CSaz zostało oczyszczonych z różnych szczepów bakteryjnych, ale CSase ABC, CSase AC I i CSase B są najczęściej używane ze względu na ich specyficzność wiązania z substratem. Dostępny komercyjnie CSase ABC jest kombinacją dwóch enzymów oczyszczonych z Proteus vulgaris: CSase ABC I, który wykazuje aktywność endolityczną, oraz CSase ABC II, który wykazuje aktywność egzolityczną wobec CS, siarczanu dermatanu (DS) i kwasu hialuronowego (HA).

Badacze przeprowadzili szczegółową analizę potencjalnych inhibitorów CSase ABC, testując różne polisacharydy, w tym siarczan dekstranu (DexS), heparan siarczan, heparynę, kwas kolominiowy, fukoidan i dekstran. Wykorzystano kolorometryczny test z użyciem barwnika WST-1, który ulega reakcji redukcyjnej, tworząc barwny formazan w obecności końcówki redukującej. Wyższa absorbancja wskazuje na zwiększoną aktywność enzymu poprzez większy stopień hydrolizy substratu CS. Zaskakująco, spośród wszystkich testowanych polisacharydów, jedynie DexS wykazał zdolność do hamowania aktywności CSase ABC, osiągając maksymalną inhibicję przy stężeniu 10 μg/ml (40 pmol). Co istotne, nawet przy niskim stężeniu 2,5 μg/ml, DexS znacząco zmniejszał aktywność enzymu, zbliżając się do poziomów porównywalnych z kontrolą bez dodatku enzymu.

Czy struktura i długość łańcucha decydują o aktywności DexS?

Warto podkreślić, że niesufonowana forma DexS – dekstran – nie wykazywała hamowania CSase ABC. Wcześniejsze badania wykazały około 81% inhibicji CSase ABC przy użyciu heparyny w stosunku substrat:inhibitor 1:1. Tymczasem skuteczność DexS jest znacznie większa, osiągając blisko 90% inhibicji przy stosunku substrat:inhibitor 10:1. Inne silnie ujemnie naładowane polisacharydy, takie jak fukoidan (grupy siarczanowe) i kwas kolominiowy (grupy karboksylowe), nie hamowały aktywności CSase ABC w badanych stężeniach. DexS został wcześniej zidentyfikowany jako silny inhibitor innych liaz GAG, takich jak hialuronidaza, gdzie DexS okazał się nietoksycznym inhibitorem degradacji HA obserwowanej w linii komórkowej gruczolakoraka piersi. DexS wykazał również obiecujące działanie w hamowaniu zakażeń HIV-1 i innych infekcji wirusowych.

Badacze sprawdzili również, czy długość polimeru DexS wpływa na jego zdolność do hamowania aktywności CSase ABC. Przeprowadzono hydrolizę kwasową DexS w różnych przedziałach czasowych (2, 5, 15, 30, 45, 60 minut) i oceniono wpływ produktów hydrolizy na aktywność enzymu. Zmniejszenie długości łańcucha DexS potwierdzono za pomocą elektroforezy SDS-PAGE oraz chromatografii żelowej (GPC). Wyniki wykazały, że DexS wykazuje zmniejszony efekt hamujący wraz ze skróceniem długości łańcucha. Po 15 minutach hydrolizy, krótsze łańcuchy o niższej masie cząsteczkowej nie wykazywały już hamowania aktywności CSase. Porównanie punktów czasowych hydrolizy 2 i 5 minut z punktem 15 minut ujawniło wyraźny efekt hamujący zależny od rozmiaru, przy czym polimery DexS o masie 7 kDa lub mniejszej nie wykazywały hamowania aktywności CSase ABC.

Zmiany w długości łańcucha DexS wpływają również na jego aktywność jako antykoagulantu i inhibitora szlaków dopełniacza. W immunologii, DexS o niskiej masie cząsteczkowej (LMW DexS, < 10 kDa) wykazał skuteczność w hamowaniu wszystkich trzech szlaków dopełniacza, kluczowego mechanizmu rozpoznawania patogenów w odporności wrodzonej. LMW DexS był również wykorzystywany jako czynnik ochronny komórek śródbłonka przed cytotoksycznością komórek NK, podkreślając jego potencjał w łagodzeniu prozapalnych efektów mediatorów odporności wrodzonej. Niedawne badania porównały różne rozmiary DexS jako środka przeciwwirusowego przeciwko SARS-CoV-2, gdzie DexS o masie 500 kDa wykazał silne właściwości przeciwwirusowe w porównaniu do krótszych łańcuchów, demonstrując skuteczność przeciwwirusową porównywalną z zatwierdzonym klinicznie lekiem Remdesivir. Badania te sugerowały również, że interwencja długołańcuchowego DexS celuje głównie we wczesne etapy infekcji, pozycjonując go jako obiecującego kandydata do terapii przeciwwirusowej. Jednakże wciąż istnieją wyzwania w optymalizacji podawania DexS w celu zwiększenia jego biodostępności, co przyczynia się do obecnego sceptycyzmu dotyczącego stosowania inhibitorów wirusowych opartych na polimerach.

Opisane badanie przedstawia hamowanie aktywności CSase ABC specyficznie przez polimery DexS i pokazuje, że hamowanie to zależy od typu monosacharydu, stopnia sulfonowania i długości łańcucha polimeru. DexS, sulfonowany analog dekstranu, jest wysoce rozpuszczalnym w wodzie polimerem, wcześniej znanym z hamującego wpływu na aktywność polimerazy RNA, odwrotnej transkryptazy oraz hialuronidazy jądrowej bydlęcej (HAase) i bakteryjnej HAase.

Dalsze badania nad innymi znanymi homologami liaz CS i innych enzymów degradujących GAG będą interesujące do określenia w przyszłości. Podchodząc do CSase ABC z biochemicznej perspektywy, badanie to może dostarczyć mechanistycznego wglądu w hamowanie enzymu przez pojedynczy polimer, DexS, który wcześniej nie był znany z hamowania degradacji CS. Ponadto, praca ta stanowi platformę do oceny inhibitorów polisacharydowych enzymów specyficznych dla GAG. Poszerza ona zakres testów enzymatycznych o szerszy zakres enzymów degradujących GAG i wspiera badania nad inhibicją enzymów przy użyciu mimetyków GAG i innych małych cząsteczek. Ten test może być potencjalnym narzędziem do kontroli jakości w terapeutykach opartych na inhibitorach, pomagając w identyfikacji i optymalizacji skutecznych inhibitorów.

Podsumowanie

Badania wykazały, że siarczan dekstranu (DexS) jest skutecznym inhibitorem chondroitynazy ABC (CSase ABC), osiągając maksymalną inhibicję przy stężeniu 10 μg/ml. Skuteczność DexS jest zależna od trzech kluczowych czynników: typu monosacharydu, stopnia sulfonowania oraz długości łańcucha polimeru. Najwyższą aktywność wykazują długołańcuchowe formy DexS (>7 kDa), podczas gdy krótsze łańcuchy tracą właściwości hamujące. DexS osiąga około 90% inhibicji przy stosunku substrat:inhibitor 10:1, co przewyższa skuteczność innych znanych inhibitorów. Odkrycie to ma potencjalne zastosowanie w leczeniu urazów rdzenia kręgowego, gdzie enzymatyczna degradacja siarczanu chondroityny odgrywa istotną rolę w procesie regeneracji.

Bibliografia

Dalal Sagar, Pathak Rachana, Moh Edward X. S. and Packer Nicolle H.. Inhibition of chondroitin sulphate-degrading enzyme Chondroitinase ABC by dextran sulphate. Glycoconjugate Journal 2025, 42(1), 53-59. DOI: https://doi.org/10.1007/s10719-024-10175-6.