Hydrożel ze spermiminą w terapii RZS: nowe możliwości ochrony stawów

Czy hydrożel ze spermiminą może zahamować destrukcję stawów w RZS?

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) dotyka 0,5-1% populacji światowej i charakteryzuje się przewlekłym zapaleniem błony maziowej, postępującą degradacją chrząstki oraz erozją kości. Mimo postępów w terapii biologicznymi lekami modyfikującymi przebieg choroby (bDMARDs), około 30-40% pacjentów nie osiąga optymalnej odpowiedzi, a nieodwracalne uszkodzenie stawów pozostaje główną przyczyną długotrwałego upośledzenia funkcji.

Kluczową rolę w patogenezie RZS odgrywają zaburzone szlaki sygnałowe PI3K/AKT, które nasilają stan zapalny i degradację macierzy pozakomórkowej (ECM). W mikrośrodowisku zapalnym chondrocyty wykazują zwiększoną podatność na apoptozę, zmniejszoną zdolność proliferacyjną oraz zaburzenia metabolizmu ECM. Cytokiny prozapalne – szczególnie IL-1β i TNF-α – aktywują szlaki NF-κB i MAPK, promując regulację w górę metaloproteinaz macierzy (MMPs), zwłaszcza MMP-1, MMP-3 i MMP-13, które degradują kolagen typu II i aggrekan.

Spermidyna (SPD) – endogenny induktor autofagii – wykazuje podwójne właściwości przeciwzapalne i cytoprotekcyjne poprzez supresję NF-κB i aktywację szlaku Nrf2. Choć SPD wykazała skuteczność w chorobach zwyrodnieniowych stawów, jej potencjalne zastosowanie w RZS pozostaje w dużej mierze niezbadane. Jednocześnie siarczan chondroityny (CS) – naturalny glikozaminoglikan i kluczowy składnik strukturalny chrząstki – wykazuje działanie przeciwzapalne, antyoksydacyjne i chondroindukcyjne. Funkcjonalizowana metakryloilem CS (ChSMA) stanowi fotosieciowalne prekursory hydrożelu, umożliwiając konstrukcję wstrzykiwalnych, biokompatybilnych rusztowań.

Jak zaprojektowano system dostawowy ChSMA@SPD?

Zespół z Peking University Shenzhen Hospital opracował hydrożel ChSMA enkapsulujący spermidinę (ChSMA@SPD) do podania dostawowego. Badania przeprowadzono w trzech uzupełniających się modelach: in vitro z wykorzystaniem organoidów błony maziowej pochodzących od pacjentów z RZS w układzie współhodowli z chondrocytami, ex vivo na pierwotnych osteokastach mysich oraz in vivo w modelu CIA (collagen-induced arthritis) u myszy DBA/1.

W badaniach in vivo myszy (n=8/grupa) otrzymywały SPD dootrzewnowo (60 mg/kg, 2×/tydzień) lub ChSMA@SPD dostawowo (60 mg/kg, 2×/tydzień, objętość 10 μL) przez 3 tygodnie po wtórnej immunizacji. Oceniano nasilenie zapalenia stawów w skali 0-4, obrzęk łap, parametry kostne (micro-CT) oraz zmiany histopatologiczne (H&E, barwienie safraniny O).

Model organoidów błony maziowej konstruowano z tkanki maziowej pacjentów z RZS przy użyciu celulozy bakteryjnej. Organoidly te wydzielały cytokiny prozapalne (TNF-α, IL-6, IL-8), czynniki angiogenne (VEGF) oraz enzymy degradujące chrząstkę (MMP3, ADAMTS5), co potwierdzało ich molekularną istotność dla patologii RZS.

Jakie właściwości wykazuje hydrożel ChSMA@SPD?

Analiza fizykochemiczna wykazała, że ChSMA@SPD charakteryzuje się porowatą, wzajemnie połączoną mikrostrukturą bez zauważalnych różnic w morfologii porów w porównaniu z ChSMA. Wskaźnik pęcznienia nie różnił się istotnie między grupami, co sugeruje minimalny wpływ enkapsulacji SPD na zdolność absorpcji wody.

Analiza reologiczna ujawniła, że ChSMA@SPD wykazywał istotnie wyższy moduł sprężystości (G′) w porównaniu z samym ChSMA (p<0,01), wskazując na wzmocnione zachowanie elastyczne. Lepkość pozostawała stabilna w czasie i była porównywalna między grupami. Analiza naprężenie-odkształcenie wykazała podobną elastyczność ściskającą, podczas gdy retencja wody przy 37°C zmniejszała się stopniowo, przy czym ChSMA@SPD zatrzymywał nieco więcej wilgoci we wczesnym stadium.

Badania uwalniania leku wykazały, że SPD była uwalniana z hydrożelu w sposób ciągły, przy czym większość uwalniania następowała w ciągu pierwszych 8 godzin, po czym następowała faza plateau – typowy profil burst-sustained release odpowiedni do dostawy miejscowej. Testy hemokompatybilności wykazały wskaźnik hemolizy <5%, spełniający normę ISO dla materiałów biomedycznych. Barwienie live/dead chondrocytów hodowanych w hydrożelu wykazało wysoką żywotność komórek w dniu 3 i 5, potwierdzając dobrą cytokompatybilność.

Jak ChSMA@SPD wpływa na aktywność organoidów błony maziowej z RZS?

Błona maziowa stanowi kluczowe miejsce patologiczne u pacjentów z RZS, gdzie środowisko zapalne odgrywa krytyczną rolę w progresji choroby. Trójwymiarowe organoidly błony maziowej pochodzące od pacjentów z RZS wydzielały różnorodne cytokiny związane z patologią RZS, w tym czynniki zapalne (TNF-α, IL-6, IL-8), angiogenne (VEGF) i chemokiny (MCP-1), a także czynniki degradujące chrząstkę, takie jak MMP3 i ADAMTS5.

Dalsze analizy wykazały, że ChSMA@SPD istotnie hamował wzrost i aktywność organoidów błony maziowej. Obrazowanie w jasnym polu ujawniło, że nieleczone organoidly wykazywały charakterystyczne struktury trójwymiarowe, podczas gdy leczenie ChSMA@SPD wyraźnie zmniejszało rozmiar organoidów i aktywność komórkową. Wyniki te sugerują, że ChSMA@SPD tłumi patologiczną aktywność organoidów błony maziowej, modulując tym samym środowisko maziowe RZS.

Czy model współhodowli odtwarza zmiany patologiczne w RZS?

Zespół opracował model patologii chondrocytów związanych z RZS poprzez współhodowlę organoidów błony maziowej RZS z chondrocytami. Schemat przedstawia system współhodowli, w którym organoidly błony maziowej RZS są współhodowane z chondrocytami w celu symulacji uszkodzenia chrząstki i zmian patologicznych związanych z RZS.

W warunkach współhodowli podłoże kondycjonowane (CM) wydzielane przez organoidly błony maziowej istotnie indukowało apoptozę chondrocytów. Wyniki zarówno z testu CCK-8, jak i EdU potwierdziły, że CM organoidów błony maziowej hamowało proliferację chondrocytów. Dodatkowo barwienie immunofluorescencyjne ujawniło, że CM organoidów błony maziowej prowadziło do wyraźnego zmniejszenia ekspresji Col2a1 – kluczowego markera chrząstki – oraz zwiększenia ekspresji MMP9, markera degradacji chrząstki.

Analiza Western blot dodatkowo wykazała, że leczenie CM tłumiło ekspresję Birc5, jednocześnie promując ekspresję MMP3. Aby dodatkowo wzmocnić fizjologiczną istotność, zespół wdrożył konfigurację współhodowli Transwell bez kontaktu oraz wariant leczenia, w którym organoidly błony maziowej były łączone z chondrocytami w obecności ChSMA@SPD. Ten wariant odtworzył szkodliwy fenotyp zaobserwowany przy konwencjonalnej ekspozycji na CM (apoptoza i katabolizm macierzy), podczas gdy ChSMA@SPD łagodziło te efekty – zmniejszając apoptozę chondrocytów, tłumiąc indukcję IL-1α/IL-1β/IL-6/IL-8, obniżając MMP9 i częściowo przywracając organizację F-aktyny oraz ekspresję Col2a1.

W jaki sposób ChSMA@SPD chroni chondrocyty?

Aby ocenić bioaktywność hydrożelu ChSMA@SPD na chondrocyty w środowisku zapalnym, zespół zastosował model 2D, w którym komórki traktowano podłożem kondycjonowanym organoidów błony maziowej, z lub bez ekstraktu ChSMA@SPD. Cytometria przepływowa ujawniła istotną redukcję wczesnych i późnych apoptotycznych chondrocytów po 24h i 48h leczenia ekstraktem ChSMA@SPD w porównaniu z samym CM, wskazując, że ekstrakt hydrożelu skutecznie hamował apoptozę komórek indukowaną zapaleniem.

Testy proliferacji EdU dodatkowo potwierdziły, że leczenie ChSMA@SPD zwiększało proliferację chondrocytów w stosunku do kontroli leczonej CM. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że ekstrakt ChSMA@SPD zmniejszał ekspresję metaloproteinazy macierzy 9 (MMP9), jednocześnie przywracając ekspresję kolagenu typu II (Col2a1), wskazując na poprawę zachowania ECM.

Analiza ekspresji genów metodą qRT-PCR wykazała, że ChSMA@SPD regulowało w dół cytokiny zapalne (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8), markery apoptozy (Bax) i enzymy kataboliczne (MMP9), jednocześnie regulując w górę gen antyapoptotyczny Bcl2 i marker związany z chrząstką Col2a1. Konsekwentnie, Western blotting wykazał, że ChSMA@SPD zmniejszało indukowaną przez CM fosforylację PI3K i AKT, pozostawiając całkowite poziomy białka niezmienione; co istotne, to zmniejszenie zostało zniesione przez aktywator AKT SC-79 (reverse-rescue) i fenokopowane przez inhibitor PI3K LY294002.

Co ujawniła analiza transkryptomiczna?

Aby dodatkowo zbadać potencjalne mechanizmy, którymi CM z organoidów błony maziowej współhodowanych z chondrocytami promuje cechy patologiczne związane z RZS w chondrocytach, zespół przeprowadził sekwencjonowanie transkryptomiczne. Analiza różnicowych genów wykazała, że po leczeniu CM 1561 genów było regulowanych w górę, a 1187 genów w dół (p<0,05, |log2Foldchange|≥2).

Wykres hantle ilustruje, że geny związane z zapaleniem, w tym IL-6, były regulowane w górę, podczas gdy geny związane z degradacją chrząstki i przebudową macierzy, takie jak MMP3, MMP9 i ADAMTS5, były regulowane w dół. Analiza wzbogacania KEGG ujawniła, że leczenie CM promowało różnicowanie osteoklastów i aktywację szlaku sygnałowego TNF. Dodatkowo analiza KEGG regulowanych w dół genów wskazała ich udział w procesach takich jak trawienie i wchłanianie białek oraz interakcje ligand-receptor neuroaktywnych.

Analiza GO wykazała, że regulowane w górę geny były głównie zaangażowane w odpowiedzi zapalne i odpowiedzi immunologiczne wrodzone, podczas gdy regulowane w dół geny były głównie zaangażowane w negatywną regulację różnicowania osteoblastów i samo różnicowanie osteoblastów. Leczenie CM aktywowało sygnalizację PI3K-AKT i zakłócało homeostazę chrząstki, co pokazano przez zwiększone p-PI3K/p-AKT i podwyższone MMP3/MMP9, wraz ze zmniejszonym Col2a1 i IL-10.

Profilowanie transkryptomiczne chondrocytów leczonych CM organoidów błony maziowej i ekstraktem ChSMA@SPD ujawniło znaczące zmiany we wzorcach ekspresji genów związanych z modulacją zapalenia i naprawą tkanek. Analiza wykresu wulkanicznego dodatkowo zidentyfikowała 802 geny regulowane w górę i 725 genów regulowanych w dół (p<0,05, |log2Foldchange|≥2) w grupie ChSMA@SPD, sugerując jej silne efekty regulacyjne na aktywność chondrocytów.

Należy zauważyć, że geny zaangażowane w odpowiedzi zapalne (np. IL6, TNF-α) były istotnie stłumione, podczas gdy te związane z syntezą macierzy pozakomórkowej (ECM) (np. COL2A1, ACAN) były wyraźnie zwiększone. Analiza wzbogacania szlaków KEGG podkreśliła, że regulowane w górę geny były istotnie wzbogacone w szlaki związane z odpowiedzią immunologiczną, sygnalizacją zapalną i degradacją chrząstki, takie jak szlak sygnałowy NF-κB i szlak sygnałowy MAPK.

Czy ChSMA@SPD hamuje różnicowanie osteoklastów?

Zespół zbadał również wpływ ChSMA@SPD na aktywność osteoklastów. Pierwotne osteoklasty izolowano ze szpiku kostnego myszy, różnicowano poprzez stymulację RANKL, a następnie leczono rosnącymi stężeniami ChSMA@SPD (0-20 μM). Analiza RT-qPCR wykazała, że leczenie ChSMA@SPD wyraźnie regulowało w dół geny markerowe specyficzne dla osteoklastów (np. Nfatc1, Ctsk), sugerując jego hamujący wpływ na różnicowanie osteoklastów na poziomie transkrypcyjnym.

Kolejne barwienie TRAP ujawniło zależną od dawki supresję aktywności osteoklastów, co potwierdzają stopniowo zmniejszone obszary TRAP-dodatnie wraz ze wzrastającymi stężeniami ChSMA@SPD. Barwienie immunofluorescencyjne F-aktyny dodatkowo potwierdziło te odkrycia, ujawniając zakłóconą formację pierścienia aktyny w osteokastach leczonych ChSMA@SPD – cechę charakterystyczną upośledzonej funkcji resorpcyjnej i nieprawidłowej morfologii.

Analiza RT-qPCR wykazała istotną supresję ekspresji MMP9 równoczesną z regulacją w górę proapoptotycznego białka bax w osteokastach leczonych SPD. Aby określić, czy efekty antyosteokastogenne ChSMA@SPD obejmowały modulację fuzji komórek, zespół ocenił ekspresję DC-STAMP poprzez zintegrowane analizy RT-qPCR i Western blot. Zarówno obfitość białka, jak i poziomy mRNA tego krytycznego regulatora fuzji zostały istotnie zmniejszone po podaniu ChSMA@SPD.

Jakie efekty wykazano w modelu CIA u myszy?

Aby zbadać skuteczność terapeutyczną ChSMA@SPD w RZS, zespół ustanowił model CIA u myszy DBA/1. SPD (60 mg/kg masy ciała) podawano drogą dożołądkową dwa razy w tygodniu przez 3 tygodnie, podczas gdy ChSMA@SPD podawano poprzez iniekcję dostawową. Parametry kliniczne, w tym wyniki zapalenia stawów, częstość występowania choroby i obrzęk tylnych łap, były systematycznie rejestrowane w całym okresie obserwacji.

W porównaniu z grupą modelu CIA, zarówno leczenie SPD, jak i ChSMA@SPD istotnie zmniejszyło wyniki zapalenia stawów, wskazując na wyraźne złagodzenie nasilenia choroby. Ponadto częstość występowania zapalenia stawów była istotnie niższa w grupach leczonych SPD i ChSMA@SPD. Masa ciała pozostała stabilna w okresie leczenia, a badanie histopatologiczne głównych narządów (serce, wątroba, śledziona, płuca, nerki) poprzez barwienie H&E nie wykazało nieprawidłowości związanych z leczeniem, potwierdzając ogólnoustrojowe bezpieczeństwo zarówno SPD, jak i ChSMA@SPD.

Dodatkowo leczenie SPD i ChSMA@SPD istotnie zmniejszało obrzęk stawów, wykazując działanie przeciwzapalne. Analiza histologiczna stawów kolanowych wykazała zmniejszoną hiperplazję błony maziowej i mniejszą infiltrację komórek zapalnych w obu grupach leczenia, co potwierdzono barwieniem H&E. Barwienie safraniny O-Fast Green dodatkowo ujawniło, że zarówno SPD, jak i ChSMA@SPD istotnie łagodziły uszkodzenie chrząstki u myszy CIA.

Obrazowanie Micro-CT również potwierdziło, że leczenie SPD i ChSMA@SPD zmniejszało erozję kości w stawach kolanowych i skokowych, poprawiało integralność kości i minimalizowało zniszczenie strukturalne. Analiza ilościowa parametrów kostnych, w tym frakcji objętości kości (BV/TV) i grubości beleczek (Tb.Th), dodatkowo wykazała efekty ochronne SPD na mikrostrukturę kości (p<0,05).

Aby zbadać potencjalne mechanizmy, którymi ChSMA@SPD zmniejsza zapalenie stawów i promuje naprawę chrząstki, zespół przeanalizował ekspresję markerów makrofagów M1 i białek związanych z chrząstką w stawach CIA. Barwienie immunofluorescencyjne ujawniło istotne zmniejszenie markera makrofagów M1 iNOS w grupie leczonej ChSMA@SPD w porównaniu z grupą modelu CIA. To odkrycie sugeruje, że ChSMA@SPD moduluje polaryzację makrofagów i zmniejsza aktywność makrofagów prozapalnych w tkance maziowej.

Ponadto leczenie ChSMA@SPD prowadziło do istotnej regulacji w dół markera degradacji chrząstki MMP3 i zauważalnej regulacji w górę markera naprawy chrząstki COL2A. Analiza qPCR dodatkowo potwierdziła te odkrycia, pokazując, że ChSMA@SPD istotnie tłumiło ekspresję genów prozapalnych (w tym IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 i TNF-α) i genów związanych z degradacją chrząstki (takich jak MMP3 i MMP13), jednocześnie zwiększając ekspresję genów związanych z regeneracją chrząstki (takich jak Runx2, Col2a, i BMP-2) w tkance stawowej.

Jakie cele molekularne identyfikuje farmakologia sieciowa?

Aby zidentyfikować potencjalne cele molekularne SPD w chondrocytach związanych z RZS, zespół przeprowadził kompleksową analizę farmakologii sieciowej i dokowania molekularnego. Łącznie 2229 celów związanych z RZS pobrano przy użyciu słowa kluczowego “Rheumatoid arthritis” z baz danych GeneCards, DisGeNET i OMIM, podczas gdy 81 celów związanych z SPD uzyskano z DrugBank, PharmMapper i SwissTargetPrediction przy użyciu słowa kluczowego “Spermidine”.

Poprzez przecięcie dwóch zestawów genów zidentyfikowano 24 nakładające się cele i zwizualizowano w diagramie Venna. Aby dodatkowo zbadać interakcje między tymi nakładającymi się celami, skonstruowano sieć interakcji białko-białko (PPI) przy użyciu platformy GeneMANIA. Aby zawęzić kandydatów terapeutycznych związanych z chrząstką, wybrano cztery cele ściśle związane z homeostazą kości i chrząstki – TGFβ2, XIAP, PLA2G1B i MMP8 – do analizy dokowania molekularnego.

Struktury krystaliczne 3D białek pobrano z bazy danych RCSB PDB, a strukturę 3D SPD pobrano z PubChem. Dokowanie molekularne przeprowadzono przy użyciu Discovery Studio, a wyniki wiązania zwizualizowano przy użyciu PyMOL i Blender 4.4.1. Wśród czterech białek TGFB2 wykazywało najwyższe powinowactwo wiązania z SPD, z energią interakcji -CDOCKER wynoszącą 77,2473 kcal/mol, sugerując silny potencjał wiązania.

Szczegółowa analiza wiązania ujawniła, że SPD tworzy stabilne mostki solne i korzystne interakcje ładunkowe z ASP B-32 i GLU B-100, a także tworzy wiązania wodorowe z ASP A-215 i GLU B-100, wskazując na korzystną interakcję receptor-ligand. Wysokopowinowactowe wiązanie SPD z TGFB2 wspiera jego potencjalną rolę w chondroprotekcji podczas progresji RZS.

W kontekście porównawczych analiz z metotreksatem-DHFR, hydroksychlorochiną-KIT i leflunomidem-DHODH, przewidywane energie SPD mieszczą się w zakresie tych leków pierwszego rzutu, a w kilku przypadkach wypadają korzystnie, wspierając potencjalne wielocelowe zaangażowanie SPD i domniemaną rolę chondroprotekcyjną poprzez TGFB2.

Jakie są najważniejsze wnioski z tego badania?

Badanie prezentuje hydrożel oparty na ChSMA enkapsulujący SPD jako obiecującą miejscową strategię terapeutyczną dla RZS. Poprzez kombinację modeli in vitro i in vivo, w tym system współhodowli organoidów błony maziowej pochodzących od pacjentów z chondrocytami oraz model CIA u myszy, wykazano, że ChSMA@SPD wywiera podwójne efekty ochronne poprzez łagodzenie degradacji chrząstki i hamowanie resorpcji kości mediowanej przez osteoklasty.

Mechanistycznie ChSMA@SPD tłumiło apoptozę chondrocytów, regulowało w dół cytokiny prozapalne i metaloproteinazy macierzy oraz hamowało różnicowanie osteoklastów poprzez regulację DC-STAMP. Ponadto farmakologia sieciowa i analiza dokowania molekularnego ujawniły, że SPD może modulować kluczowe szlaki zapalne i przebudowy kości, w tym sygnalizację NF-κB, PI3K/AKT i RANKL, potencjalnie poprzez bezpośrednie interakcje z białkami docelowymi, takimi jak TGFB2, XIAP, MMP8 i PLA2G1B.

Te odkrycia łącznie podkreślają ChSMA@SPD jako wielocelowy, podawany dostawowo system hydrożelowy zdolny do jednoczesnego zajmowania się zaburzeniami immunologicznymi i uszkodzeniem strukturalnym w RZS. System ten oferuje nowe spojrzenie na projektowanie interwencji terapeutycznych opartych na biomateriałach dla przewlekłych chorób stawów, choć wymaga dalszych badań klinicznych w celu potwierdzenia skuteczności i bezpieczeństwa u pacjentów.