Jak kompleksacja z żelazem rewolucjonizuje działanie siarczanu chondroityny?

Jak kompleksacja z jonami żelaza rewolucjonizuje działanie siarczanu chondroityny?

Kompleksy siarczanu chondroityny z żelazem wykazują zwiększoną biodostępność i silniejsze działanie przeciwzapalne niż sam siarczan chondroityny – dowodzą nowe badania. Odkrycie to może mieć istotne znaczenie dla rozwoju skuteczniejszych metod leczenia chorób zapalnych.

Siarczan chondroityny (CS) to anionowy siarczan glikozaminoglikanu powszechnie występujący w macierzy pozakomórkowej zwierzęcej tkanki łącznej, takiej jak chrząstki, skóra, naczynia krwionośne, ścięgna i więzadła. Łańcuch CS składa się z powtarzających się jednostek disacharydowych →4)-β-GlcA-(1→3)-β-GalNAc-(1→, a jego masa cząsteczkowa (Mw) wynosi zwykle od 10 do 100 kDa. Różnorodność strukturalna CS wynika głównie z różnic we wzorcach siarczanowania i można ją sklasyfikować na pięć typów: CS-O, CS-A, CS-C, CS-D i CS-E, które przyczyniają się do jego bioaktywności i specyfiki funkcjonalnej. CS wykazuje różnorodne działania fizjologiczne i farmakologiczne, w tym działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne, przeciwnowotworowe, neuroprotekcyjne i immunoregulacyjne. Szczególnie interesujące jest jego działanie przeciwzapalne, które wykorzystuje się w leczeniu chorób takich jak zapalenie stawów, wrzody żołądka czy zapalenie jelita grubego poprzez hamowanie aktywacji szlaków sygnałowych i regulację w dół czynników zapalnych.

Czy nowa formuła zwiększa biodostępność i poprawia dystrybucję?

Mimo udokumentowanych korzyści, skuteczność CS podawanego doustnie jest ograniczona przez jego właściwości fizykochemiczne. Duża masa cząsteczkowa, gęstość ładunku, grupy hydrofilowe i słaba rozpuszczalność w tłuszczach prowadzą do niepełnej przepuszczalności jelitowej i niskiej biodostępności (0-13%). “Problem niskiej biodostępności doustnej dotyczy wielu bioaktywnych polisacharydów, które trudno ulegają degradacji w żołądku, a ich wchłanianie zależy głównie od szlaków przezbłonowych i transportu za pośrednictwem białek nośnikowych” – wyjaśniają autorzy badania.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, naukowcy opracowali kompleksy CS z jonami żelaza. Jony metali, szczególnie Fe(III), wykazują unikalne zdolności koordynacyjne z polisacharydami, potencjalnie wpływając na ich strukturę molekularną, konformację łańcucha i rozmiar cząsteczek. “Jony żelaza mogą służyć jako centra metaliczne do tworzenia stabilnych kompleksów z ligandami organicznymi, a w porównaniu z jonami Al(III), Cu(II) i Zn(II), Fe(III) wykazuje wyższe powinowactwo do grup koordynacyjnych i demonstruje silniejszą zdolność kompleksowania” – piszą badacze. Co więcej, wcześniejsze badania wykazały, że endogenne jony metali przyczyniają się do utrzymania struktury potrójnej helisy polisacharydów lentinanu, a chelaty Fe(III) z polisacharydami jedwabiu kukurydzianego wykazywały zwiększoną aktywność przeciwutleniającą i hamowanie α-glukozydazy.

W badaniu przygotowano dwa rodzaje kompleksów: kompleks wysokocząsteczkowego siarczanu chondroityny z żelazem (CS-Fe) oraz kompleks niskocząsteczkowego siarczanu chondroityny z żelazem (LCS-Fe), wykorzystując metodę degradacji fotokatalitycznej Fentona. Siarczan chondroityny rozpuszczono w wodzie dejonizowanej (5 mg/ml) i zmieszano z 20 mM FeSO4 przy mieszaniu magnetycznym. Po 10 minutach mieszania dodano 20 mM H2O2. Mieszaninę wirowano, a supernatant dializowano przez 4 dni. Kompleks LCS-Fe przygotowano przy użyciu metody degradacji fotokatalityczno-Fentonowej, z czasem reakcji 60 minut.

Jak kompleksy zachowują się in vivo?

Aby zbadać profil absorpcji i dystrybucji kompleksów in vivo, naukowcy znakowali CS, CS-Fe i LCS-Fe 5-aminofluoresceiną, co pozwoliło na śledzenie ich zachowania w organizmie myszy po podaniu doustnym. Myszy podzielono na cztery grupy: grupę kontrolną (0,9% roztwór soli fizjologicznej), grupę CS (F-CS, 30 mg/kg masy ciała), grupę CS-Fe (F-CS-Fe, 30 mg/kg masy ciała) i grupę LCS-Fe (F-LCS-Fe, 30 mg/kg masy ciała). Myszy poświęcano po 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h i 12 h po podaniu doustnym, a następnie pobierano krew i poszczególne tkanki (serce, płuca, wątroba, żołądek, śledziona, nerki i jelito).

Wyniki były zaskakujące – poziomy osoczowe znakowanego LCS-Fe były wyraźnie wyższe niż CS-Fe i CS w ciągu 12 godzin po podaniu, z najwyższą różnicą obserwowaną po 6 godzinach. Stężenia w osoczu F-CS, F-CS-Fe i F-LCS-Fe były wyraźne już po 0,5 h po pojedynczym podaniu dożołądkowym i osiągnęły maksymalne stężenia (Cmax) po 1 h, wynosząc odpowiednio 135,27 ± 236,82 μg/ml, 376,60 ± 214,10 μg/ml i 415,16 ± 109,50 μg/ml. Co ważne, F-LCS-Fe wykazywał większą powierzchnię pod krzywą stężenia w osoczu (2449,8 μg/mL·h) i umiarkowany czas półtrwania eliminacji (3,3 h) w porównaniu z CS (501,8 μg/mL·h, 2,1 h), co sugeruje lepsze wchłanianie i wolniejszą eliminację in vivo.

Badanie dystrybucji tkankowej wykazało silne sygnały fluorescencyjne w żołądku, wątrobie i jelicie, podczas gdy niewielka fluorescencja była widoczna w sercu, płucach, śledzionie i nerkach po 0,5 h po podaniu. Sygnały fluorescencyjne obserwowane w jelicie stopniowo się kumulowały i osiągnęły szczyt odpowiednio po 6 h, 4 h i 2 h po podaniu F-CS, F-CS-Fe i F-LCS-Fe, a następnie stopniowo spadały. Intensywność fluorescencji w sercach i płucach grup podawanych nie różniła się od grupy kontrolnej, co sugeruje, że F-CS, F-CS-Fe i F-LCS-Fe prawie nie docierały do tych narządów. Co ciekawe, najwyższą średnią intensywność fluorescencji zaobserwowano w żołądku, a następnie w jelicie, wątrobie, nerce i śledzionie w grupie leczonej.

W porównaniu z F-CS-Fe i F-LCS-Fe, F-CS wykazywał najwyższą intensywność fluorescencji w żołądku i jelicie, co prawdopodobnie wynikało z dłuższego czasu przebywania w przewodzie pokarmowym i niższej przepuszczalności w warstwie komórek śluzowych jako makrocząsteczka. Średnie intensywności fluorescencji F-CS-Fe i F-LCS-Fe w wątrobie były znacznie wyższe niż F-CS, co może wynikać z faktu, że wątroba jest głównym organem magazynującym żelazo, co prowadzi do akumulacji kompleksów niosących żelazo.

Czy kompleksacja wzmacnia działanie przeciwzapalne?

Czy modyfikacja strukturalna wpływa również na działanie przeciwzapalne? Aby odpowiedzieć na to pytanie, badacze wykorzystali model komórkowy RAW 264.7 – makrofagi stymulowane lipopolisacharydem (LPS). Makrofagi odgrywają kluczową rolę w odpowiedziach immunologicznych, uwalniając mediatory zapalne (NO, iNOS, COX-2) i cytokiny prozapalne (IL-6, TNF-α, IL-1β) po kontakcie z antygenami.

Najpierw przeprowadzono test MTT, aby określić żywotność komórek RAW 264.7. Wyniki wykazały, że CS, CS-Fe i LCS-Fe promowały proliferację makrofagów w stężeniach 100-800 μg/ml, a wskaźniki proliferacji nieznacznie spadły przy 1000 μg/ml dla CS-Fe i LCS-Fe. Dlatego stężenia 100 μg/ml i 200 μg/ml określono jako bezpieczne dawki, które zbliżone są do normalnych warunków wzrostu komórek RAW 264.7 dla kolejnych eksperymentów dotyczących aktywności przeciwzapalnej.

Wyniki były jednoznaczne – zarówno CS-Fe, jak i LCS-Fe znacząco hamowały wydzielanie NO oraz ekspresję genów iNOS i COX-2 w sposób zależny od dawki. Interwencja z CS, CS-Fe i LCS-Fe (200 μg/mL) znacznie zmniejszyła poziomy ekspresji iNOS odpowiednio o 58,8%, 74,9% i 64,7% oraz COX-2 o 20,5%, 23,2% i 32,2%. Podobnie, kompleksy CS-Fe i LCS-Fe istotnie obniżały ekspresję genów cytokin prozapalnych, przy czym LCS-Fe w stężeniu 200 μg/mL wykazywał największą redukcję TNF-α i IL-1β odpowiednio o 39,18% i 60,48%.

Co ciekawe, analiza metabolomiczna wykazała, że LPS indukuje przeprogramowanie metaboliczne w makrofagach, wpływając na 37 metabolitów wspierających fenotyp prozapalny. W porównaniu z grupą kontrolną, leczenie LPS zwiększyło 26 metabolitów, takich jak S-metylo-5-tioadenozyna (MTA), prolina, fenyloalanina, walina, i wiele innych, a zmniejszyło 11 metabolitów, takich jak 2-metylonikotynamid, monofosforan urydyny (UMP), monofosforan guanozyny i inne. Jednak CS, CS-Fe i LCS-Fe odwracały poziomy odpowiednio 10, 12 i 10 z tych metabolitów. Analiza wzbogacenia KEGG wskazała na biosyntezę waliny, leucyny i izoleucyny jako najbardziej wyraźny szlak, na który wpływa leczenie LPS, a który był odwracany przez CS, CS-Fe i LCS-Fe.

Walina i leucyna, jako aminokwasy rozgałęzione, są znane z aktywacji szlaku P13K/PKB i indukowania odpowiedzi immunologicznych Th2 i zapalenia eozynofilowego. Zwiększona synteza proliny występuje w makrofagach w warunkach zapalnych w celu utrzymania wewnątrzkomórkowej homeostazy redoks i przeciwdziałania hipoksji. MTA jest znany z kontrolowania zapalnego mikrośrodowiska tkanek nowotworowych i indukowania apoptozy. Betaina wywiera działanie przeciwzapalne w komórkach RAW 264.7 indukowanych LPS poprzez hamowanie szlaku sygnałowego NF-κB.

“Nasze badanie pokazuje, że kompleksacja siarczanu chondroityny z jonami żelaza nie tylko zwiększa jego biodostępność, ale również wzmacnia działanie przeciwzapalne poprzez modulację kluczowych szlaków metabolicznych w komórkach odpornościowych” – podsumowują badacze.

Jakie są kliniczne implikacje zmodyfikowanych kompleksów?

Modyfikacja strukturalna CS poprzez kompleksację z żelazem może prowadzić do opracowania skuteczniejszych suplementów i leków przeciwzapalnych o lepszej biodostępności. Warto jednak zauważyć, że podwyższone stężenia CS-Fe i LCS-Fe w krwiobiegu mogą potencjalnie stwarzać ryzyko toksyczności systemowej indukowanej żelazem. Jednak liczne badania wykazały, że łączenie jonów żelaza z biokompatybilnymi materiałami, takimi jak polisacharydy, polimery, dendrymerami i węglowodanami, zmniejsza lub unika ryzyka toksyczności systemowej (efekty cytotoksyczne, genotoksyczne i hemolityczne) nieorganicznego żelaza i lepiej spełnia wymagania bezpieczeństwa jako doustny czynnik biologiczny.

Czy te odkrycia zmienią podejście do stosowania siarczanu chondroityny w praktyce klinicznej? W jaki sposób można wykorzystać zmodyfikowane kompleksy CS w terapii chorób zapalnych? Potrzebne są dalsze badania, szczególnie dotyczące długoterminowego bezpieczeństwa i skuteczności u ludzi, ale wyniki te otwierają obiecujące perspektywy dla pacjentów z chorobami zapalnymi, którzy mogliby skorzystać z ulepszonej wersji tego popularnego suplementu.

Podsumowanie

Przeprowadzone badania wykazały, że kompleksacja siarczanu chondroityny (CS) z jonami żelaza prowadzi do powstania związków o znacznie lepszych właściwościach farmakologicznych. Opracowano dwa rodzaje kompleksów: wysokocząsteczkowy CS-Fe oraz niskocząsteczkowy LCS-Fe. Badania in vivo potwierdziły, że kompleksy te charakteryzują się wyższą biodostępnością i lepszą dystrybucją tkankową w porównaniu z niemodyfikowanym CS. Szczególnie istotne okazało się silniejsze działanie przeciwzapalne nowych kompleksów, co potwierdzono w badaniach na komórkach makrofagów. Kompleksy skutecznie hamowały wydzielanie mediatorów zapalnych i ekspresję genów prozapalnych. Analiza metabolomiczna wykazała, że związki te wpływają na kluczowe szlaki metaboliczne związane z procesami zapalnymi. Te odkrycia otwierają nowe możliwości w rozwoju skuteczniejszych terapii przeciwzapalnych, choć konieczne są dalsze badania nad długoterminowym bezpieczeństwem i skutecznością u ludzi.