Morski siarczan chondroityny jako nowa nadzieja w leczeniu NASH

Czy morskie CS może zmienić oblicze leczenia NASH?

Siarczan chondroityny pochodzenia morskiego wykazuje obiecujące działanie w redukcji stłuszczenia i stresu oksydacyjnego w modelu NASH, modulując funkcje organelli komórkowych. Badania przeprowadzone na komórkach HepG2 poddanych działaniu oleinianu sodu (NaOl) dostarczają nowych informacji na temat potencjalnego mechanizmu terapeutycznego w niealkoholowym stłuszczeniowym zapaleniu wątroby.

Niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH) stanowi progresywną formę niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD), będąc istotnym czynnikiem ryzyka rozwoju marskości, raka wątrobowokomórkowego i zgonów związanych z chorobami wątroby. Patogeneza NASH obejmuje złożone współdziałanie zaburzeń metabolizmu lipidów, stresu oksydacyjnego i przewlekłego stanu zapalnego, prowadzących do zakłócenia homeostazy organelli komórkowych i uszkodzenia hepatocytów. Obecne strategie terapeutyczne opierają się głównie na modyfikacji stylu życia, jednak ich skuteczność pozostaje ograniczona. Dotychczas zatwierdzono tylko jeden lek (Rezdiffra™) do leczenia NASH, co podkreśla pilną potrzebę opracowania nowych środków terapeutycznych. Alternatywne leki, takie jak uwrażliwiacze na insulinę (np. metformina, liraglutyd) czy inhibitory syntezy lipidów (np. statyny), ukierunkowane są głównie na regulację glukozy lub utlenianie lipidów, jednak nie rozwiązują złożonego problemu interakcji między dysfunkcją metaboliczną a uszkodzeniami oksydacyjnymi.

Jakie mechanizmy komórkowe modulują funkcje organelli w NASH?

Dysfunkcja organelli odgrywa kluczową rolę w progresji NASH, głównie poprzez upośledzenie funkcji krytycznych organelli metabolicznych, takich jak krople lipidowe (LD), mitochondria i lizosomy. Zaburzenia w punktach kontaktowych między kroplami lipidowymi a mitochondriami zakłócają transport kwasów tłuszczowych, nasilając lipotoksyczność i nadprodukcję reaktywnych form tlenu (ROS), podczas gdy dysfunkcja lizosomalna wzmacnia aktywację inflamasomu poprzez zaburzenie szlaku sygnałowego mTORC1. Mimo postępów w technikach obrazowania podkomórkowego, niewiele terapeutyków skutecznie reguluje koordynację wielu organelli w celu przywrócenia homeostazy metabolicznej.

Siarczan chondroityny (CS) pochodzenia morskiego, pozyskiwany z chrząstki rekina, wykazuje unikalne cechy strukturalne w porównaniu do źródeł lądowych. Podczas gdy CS pochodzenia ssaczego charakteryzuje się głównie 4-O-siarczkowaniem (CS-A), CS morski wykazuje wyjątkowe 6-O-siarczkowanie (CS-C) oraz większą zawartość disacharydów di-siarczanowanych, takich jak 4,6-di-O-siarczkowanie (CS-E) i 2,6-di-O-siarczkowanie (CS-D). Wcześniejsze badania wskazują, że CS morski łagodzi stan zapalny i uszkodzenia oksydacyjne wywołane hiperlipidemią, a CS-E zmniejsza akumulację triglicerydów w wątrobie i łagodzi uszkodzenia tego narządu. Jednak jego mechanizmy subkomórkowe, szczególnie rola w organizacji interakcji między organellami, pozostawały dotąd niezbadane.

Jak CS działa w modelu komórkowym NASH?

W badaniu wykorzystano komórki HepG2 traktowane oleinianem sodu (NaOl) jako model NASH. Wykazano, że ekspozycja na 100 μM NaOl przez 24 godziny skutecznie odtwarza charakterystyczne cechy NASH – akumulację lipidów i stres oksydacyjny – bez znaczącej cytotoksyczności. Zawartość triglicerydów wykazała zależny od dawki wzrost, przy czym 100 μM NaOl powodowało 2,2-krotny wzrost w porównaniu do kontroli. Barwienie Oil Red O potwierdziło wyraźną akumulację kropli lipidowych. Poziomy dialdehydu malonowego (MDA), markera peroksydacji lipidów, wzrosły 4,3-krotnie w komórkach traktowanych 100 μM NaOl, podczas gdy poziomy glutationu (GSH), odzwierciedlające zdolność antyoksydacyjną komórek, uległy obniżeniu.

CS wykorzystany w badaniu, pozyskany z chrząstki rekina, wykazywał głównie wzorce siarczkowania charakterystyczne dla CS morskiego, w tym CS-C, CS-D i CS-E. Przeprowadzono kompleksową charakterystykę strukturalną, aby potwierdzić jego morskie pochodzenie i zapewnić powtarzalność eksperymentalną. Spektroskopia w podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR) ujawniła kluczowe cechy: drgania rozciągające O-H (3400 cm^-1), drgania rozciągające C-H (2902 cm^-1), grupy karbonylowe (C=O, 1632 cm^-1) i N-H (1565 cm^-1), wraz z sygnaturami siarczanowymi (drgania rozciągające S=O przy 1238 cm^-1) i drganiami wiązań glikozydowych (C-O-S przy 1042 cm^-1). Szczyty przy 853 cm^-1 i 821 cm^-1 odpowiadały odpowiednio 4-O- i 6-O-siarczkowaniu, zgodnie z wzorcami siarczkowania CS morskiego.

Spektroskopia NMR ¹H i ¹³C została zastosowana do dalszego wyjaśnienia cech strukturalnych CS. Widmo ¹H NMR wykazało wyraźny sygnał przy 4,14 ppm, odpowiadający GlcA-2SO₄, co potwierdza obecność motywów 2,6-di-O-siarczkowania. Analiza korelacji sygnałów protonowych i węglowych za pomocą spektroskopii HSQC umożliwiła przypisanie odpowiednich przesunięć chemicznych węgla. Ilościowa analiza jednostek 4-O-siarczkowanych do 6-O-siarczkowanych w CS ujawniła stosunek 1,31:1. Masa cząsteczkowa została określona na 37 kDa z wąskim rozkładem. Zawartość siarczanów określono na 17,76 ± 0,33% za pomocą metody turbidymetrycznej z chlorkiem baru i żelatyną, przekraczając wartości raportowane dla CS pochodzenia ssaczego.

Dodatkowo, zastosowano analizę składu monosacharydu opartą na wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Analiza ta potwierdziła, że próbka CS zawierała głównie galaktozaminę (GalN, 53,87%) i kwas glukuronowy (GlcA, 34,13%), z niewielkim udziałem glukozaminy (GlcN, 5,59%), galaktozy (Gal, 4,39%) i mannozy (Man, 2,01%) – profil zgodny ze standardami CS pochodzącymi z rekina. Wyniki te potwierdzają charakterystykę strukturalną i morskie pochodzenie badanej próbki CS.

Testy cytotoksyczności potwierdziły, że leczenie CS w stężeniach 0, 0,5, 1, 10, 25 i 50 μg/mL nie wykazywało znaczącej cytotoksyczności w komórkach HepG2. Leczenie CS w stężeniach 10 μg/mL i 25 μg/mL znacząco zmniejszyło zawartość triglicerydów odpowiednio o 30,2% i 37,3% w porównaniu do grupy modelowej NASH. Wysokie stężenie 25 μg/mL CS jednocześnie łagodziło stres oksydacyjny poprzez zmniejszenie poziomów MDA i przywrócenie poziomów GSH. Bezpośrednia wizualizacja za pomocą mikroskopii konfokalnej potwierdziła, że CS w stężeniach 10 μg/mL i 25 μg/mL znacząco zmniejsza intensywność fluorescencji wewnątrzkomórkowych kropli lipidowych odpowiednio o 32,9% i 69,3%. Ponadto CS zmniejszył obszar pojedynczych kropli lipidowych oraz zredukował intensywność fluorescencji wewnątrzkomórkowych ROS o 61,3%.

Czy CS poprawia dynamikę lizosomalną i mitochondrialną, redukując stres oksydacyjny?

Badanie mechanizmu działania CS wykazało, że zarówno grupa modelowa NaOl, jak i grupa leczona CS wykazywały znaczący wzrost liczby lizosomów i poziomów ekspresji białka związanego z błoną lizosomalną (LAMP1). Aby ustalić, czy zwiększona liczba lizosomów wynikała z aktywności CS, a nie z stymulacji NaOl, przeprowadzono eksperymenty czasowe z inkubacją CS (1, 6, 12 i 24 h) w komórkach HepG2 indukowanych NaOl. Analiza ilościowa ujawniła zależne od czasu zwiększenie liczby lizosomów, dostarczając przekonujących dowodów na mobilizację lizosomalną wywołaną przez CS.

Funkcjonalność lizosomów zależy nie tylko od ich ilości, ale krytycznie od ich kwaśnego mikrośrodowiska. Zastosowano sondę wrażliwą na pH, gdzie niższe pH lizosomalne odpowiada wyższej intensywności fluorescencji. Indukcja NaOl prowadziła do wzrostu pH lizosomalnego w porównaniu do grupy normalnej, podczas gdy leczenie CS przywracało zakwaszenie lizosomalne. Dodatkowo, analiza przestrzenna wewnątrzkomórkowych kropli lipidowych i lizosomów ujawniła, że krople lipidowe i lizosomy były względnie odseparowane zarówno w komórkach kontrolnych, jak i indukowanych NaOl. Natomiast leczenie CS indukowało silną kolokalizację między lizosomami a kroplami lipidowymi. Analiza profili fluorescencji wyznaczonych regionów dodatkowo potwierdziła, że CS promował fuzję między kroplami lipidowymi a lizosomami.

CS znacząco zmniejszał poziomy ROS w komórkach modelu NASH. Biorąc pod uwagę, że mitochondria są odpowiedzialne za generowanie ponad 80% komórkowych ROS, przeprowadzono współbarwienie mitochondriów i ROS, aby uzyskać głębszy wgląd w subkomórkową dystrybucję ROS po leczeniu CS. W grupie indukowanej NaOl, ROS były równomiernie rozproszone w komórkach, natomiast leczenie CS indukowało przestrzenną polaryzację ROS w kierunku zakończeń mitochondrialnych.

Wcześniejsze prace wykazały, że CS promuje fragmentację mitochondriów, co skłoniło do postawienia hipotezy, czy CS mógłby usuwać fragmenty mitochondrialne bogate w ROS poprzez wzmocnienie fragmentacji mitochondriów w komórkach modelu NASH. Stwierdzono, że leczenie CS zwiększało ekspresję białka związanego z dynaminą 1 (DRP1), kluczowego białka zaangażowanego w podział mitochondriów, co promowało terminalną fragmentację mitochondriów w celu kompartmentalizacji i eliminacji ROS indukowanych przez NaOl.

Co istotne, zwiększone zakwaszenie lizosomów przez CS synergistycznie aktywowało autofagię, co potwierdzono przez zwiększone poziomy LC3-II i zmniejszone poziomy białka p62. To przygotowanie lizosomalne zapewnia efektywną degradację fragmentów mitochondrialnych obładowanych ROS poprzez mitofagię. Wyniki te wskazują, że CS łagodzi stan zapalny poprzez łączenie fragmentacji mitochondriów zależnej od DRP1 z autofagią zależną od lizosomów w celu redukcji akumulacji ROS w komórkach modelu NASH.

Aby dalej wyjaśnić rolę aktywności lizosomalnej w regulacji NASH przez CS, zastosowano specyficzne inhibitory funkcji lizosomalnej. Chlorochina (CQ) podnosi pH lizosomalne i blokuje fuzję autofagosomu z lizosomem oraz degradację LC3-II. Dodatkowo, Bafilomycyna A1 (Baf A1), silny inhibitor V-ATPazy, została wykorzystana do zakłócenia zakwaszenia i degradacji lizosomalnej. Wstępne traktowanie CQ lub Baf A1 znosiło zdolność CS do zakwaszania lizosomów, przy czym pH lizosomalne nie wykazywało znaczącej różnicy w porównaniu do grupy modelowej NASH.

Po potwierdzeniu upośledzenia funkcji lizosomalnej, przeanalizowano wewnątrzkomórkową akumulację kropli lipidowych i poziomy ROS. Zaobserwowano, że CS nie był w stanie złagodzić podwyższonych poziomów kropli lipidowych i ROS w komórkach modelu NASH wstępnie traktowanych CQ lub Baf A1. Wyniki te wspólnie dowodzą, że aktywność lizosomalna jest niezbędna dla regulacyjnych efektów CS na komórki modelu NASH, ustanawiając aktywację lizosomalną jako kluczowy mechanizm leżący u podstaw poprawy fenotypów NASH przez CS.

Patogeneza NASH jest procesem wieloaspektowym, obejmującym dysregulację lipidów, stres oksydacyjny i zaburzoną dynamikę organelli. Skuteczność CS w usuwaniu lipidów korelowała z przebudową strukturalną kropli lipidowych, zmniejszając zarówno liczbę kropli, jak i obszar pojedynczych kropli lipidowych. Sugeruje to, że CS nie tylko hamuje lipogenezę, ale także wzmacnia mobilizację lipidów, odróżniając go od konwencjonalnych środków obniżających poziom lipidów, które głównie celują w szlaki syntezy. Jednoczesna 61,3% redukcja całkowitego ROS dodatkowo podkreśla unikalną zdolność CS do adresowania zarówno metabolicznych, jak i oksydacyjnych uszkodzeń.

Podsumowując, CS pozyskiwany z chrząstki rekina wykazuje obiecujące działanie terapeutyczne w modelu NASH, adresując zarówno akumulację lipidów, jak i stres oksydacyjny poprzez synchroniczną modulację dynamiki lizosomalnej i mitochondrialnej. CS przywraca zakwaszenie lizosomalne, aktywuje lipofagię, indukuje podział mitochondriów zależny od DRP1 i optymalizuje autofagię w celu kontroli jakości organelli. Wyniki te wskazują na potencjał CS jako modulatora wielu organelli, zdolnego do rozwiązywania interakcji lipidy-ROS, oferując nowe ramy dla rozwoju terapii ukierunkowanych na wiele organelli w zaburzeniach metabolicznych.

Podsumowanie

Badania nad siarczanem chondroityny (CS) pochodzenia morskiego, pozyskiwanym z chrząstki rekina, wykazały jego znaczący potencjał w leczeniu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH). W przeprowadzonych eksperymentach na komórkach HepG2 CS skutecznie zmniejszał zawartość triglicerydów o 30-37% oraz redukował stres oksydacyjny. Mechanizm działania CS opiera się na synchronicznej modulacji dynamiki lizosomalnej i mitochondrialnej, przywracając zakwaszenie lizosomalne i optymalizując autofagię. CS wykazuje unikalne cechy strukturalne, w tym charakterystyczne wzorce siarczkowania, które odróżniają go od siarczanu chondroityny pochodzenia lądowego. Wyniki badań sugerują, że CS może stanowić obiecującą opcję terapeutyczną w leczeniu NASH, szczególnie że obecnie dostępny jest tylko jeden zatwierdzony lek na tę chorobę.