Nanocząsteczki z imatynibem przełomem w leczeniu włóknienia wątroby

Czy znamy mechanizmy włóknienia wątroby?

Włóknienie wątroby stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego, powodując ponad 2 miliony zgonów rocznie na całym świecie. Ten patologiczny proces charakteryzuje się nieprawidłowym rozrostem tkanki łącznej w wątrobie, wywołanym przez różne czynniki chorobotwórcze w przebiegu przewlekłych chorób tego narządu. Badania wykazały, że uwalnianie chemokin związanych ze stanem zapalnym, takich jak transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β) i płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF), prowadzi do aktywacji i proliferacji komórek gwiaździstych wątroby (HSCs).

Gdy dochodzi do nadmiernego wydzielania i ekspresji kolagenu przez fibroblasty, macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), szczególnie kolagen typu I i III, odkłada się w nadmiarze, powodując przewlekłą odpowiedź zapalną. Bez szybkiej interwencji lub skutecznego leczenia, włóknienie wątroby stopniowo rozwija się w zagrażającą życiu marskość, niewydolność wątroby, a nawet raka wątroby. Aktywacja HSCs została uznana za kluczowe wydarzenie podczas rozwoju włóknienia wątroby, dlatego terapia skoncentrowana na aktywowanych komórkach gwiaździstych (aHSC) stała się popularną strategią leczenia.

“Chociaż wielu badaczy próbowało zmniejszyć produkcję aktywowanych HSC lub przekształcić je w stan spoczynku, wyniki były niezadowalające, ponieważ komórki śródbłonka zatok wątrobowych (LSECs) działają jako bariera między krwią a HSC, co prowadzi do niskiej skuteczności celowania nanoformulacji w aHSC” – piszą autorzy badania.

Czy imatynib otwiera nowe drogi w terapii?

Jednym z głównych powodów słabych wyników leczenia przeciwzwłóknieniowego jest brak odpowiednich leków. Mimo że wiele małych cząsteczek jest obecnie w fazie badań klinicznych, żadna nie została zatwierdzona do terapii włóknienia wątroby ze względu na złożoną patogenezę, słabą zdolność celowania w tkanki i niskie stężenie leku w miejscach zmian chorobowych. Podejście polegające na “nowym zastosowaniu starych leków” może być potencjalnie użyteczne w leczeniu włóknienia wątroby, ponieważ bezpieczeństwo stosowanych leków jest już sprawdzone.

Imatynib (IM), nowoczesny inhibitor kinazy tyrozynowej, może selektywnie hamować dwa kluczowe szlaki sygnałowe w aktywacji HSC i fibrogenezie: szlak PDGF i TGF-β, przy czym ten drugi jest uważany za najsilniejszy znany induktor włóknienia wątroby. Dlatego oczekuje się, że będzie on lekiem kandydującym do leczenia włóknienia wątroby. Jednak obecnie dostępne na rynku formy IM to tylko tabletki i kapsułki, a konwencjonalna terapia imatynibem cierpi z powodu niskich stężeń w tkankach docelowych i zwiększonej toksyczności dla innych tkanek (zwłaszcza skóry, płuc i serca).

Jak zoptymalizować celowane dostarczanie leku?

Opracowanie odpowiedniego systemu celowanego dostarczania leków (TDDS), aby zwiększyć stężenie imatynibu w aktywowanych HSC i zmniejszyć toksyczność dla innych komórek, jawi się jako obiecująca strategia poprawy jego skuteczności terapeutycznej w leczeniu włóknienia wątroby. Siarczan chondroityny (CS), główny składnik macierzy zewnątrzkomórkowej, jest szeroko rozpowszechniony w tkankach chrzęstnych ludzi i zwierząt. Jako naturalna makrocząsteczka i substancja endogenna człowieka, CS jest idealnym nośnikiem dla imatynibu ze względu nie tylko na swoją doskonałą biokompatybilność, ale także doskonałą zdolność celowania w aHSC, która wynika z jego zdolności do wiązania się z receptorami CD44 nadekspresjonowanymi na aktywowanych komórkach gwiaździstych wątroby.

Chociaż CS ma dobre powinowactwo wiązania z aHSC, jego skrajnie hydrofilowy charakter jest niekorzystny dla dostarczania leków małocząsteczkowych. Wcześniejsze pionierskie badania z grupy badawczej profesora Gonga potwierdziły, że amfifilowy CS nie tylko wykazuje lepszą wydajność ładowania leków, ale także demonstruje lepszą zdolność celowania w aHSC.

W opisywanym badaniu naukowcy zaproponowali system dostarczania imatynibu oparty na amfifilowej pochodnej CS w celu poprawy wydajności dostarczania leku do aHSC, aby skutecznie leczyć włóknienie wątroby. W szczególności najpierw zsyntetyzowali amfifilowe koniugaty siarczanu chondroityny-1-heksadecyloaminy (CS-HDA), a następnie skonstruowali nanocząsteczki IM-CS (IM-CS NPs) metodą emulsyfikacji i odparowania rozpuszczalnika.

Czy nanotechnologia zrewolucjonizuje dostarczanie leków?

Lipofilowe łańcuchy boczne CS-HDA są wprowadzane do hydrofobowych rdzeni nanocząstek poprzez międzycząsteczkowe oddziaływania hydrofobowe, prowadząc do poprawy stabilności nanocząstek, podczas gdy hydrofilowe łańcuchy główne na powierzchniach nanocząstek działają jako ligandy celujące w aHSC poprzez endocytozę pośredniczoną przez receptor CD44. Aby dodatkowo poprawić wydajność celowanego dostarczania nanoformulacji do aHSC, rozmiary cząstek IM-CS NPs kontrolowano w zakresie 85–95 nm poprzez badanie preparatu.

Badacze najpierw ocenili poziomy wychwytu IM-CS NPs przez różne komórki przy użyciu metod znakowania fluorescencyjnego i zbadali skuteczność celowania w aHSC in vitro. Następnie przeprowadzili eksperymenty dotyczące farmakokinetyki i dystrybucji in vivo oraz walidację celowanego dostarczania do aHSC przy użyciu normalnych myszy i myszy z indukowanym czterochlorkiem węgla włóknieniem wątroby. Na koniec myszy z włóknieniem wątroby i normalne myszy zostały wykorzystane do oceny skuteczności przeciwzwłóknieniowej i przeprowadzenia wstępnej oceny bezpieczeństwa IM-CS NPs.

Aby przygotować amfifilowy koniugat CS-HDA, hydrofobowy HDA został połączony z hydrofilowym siarczanem chondroityny. Grupa aminowa HDA została przyłączona do grupy karboksylowej siarczanu chondroityny poprzez reakcję amidową, co znacznie poprawiło amfifilowość siarczanu chondroityny. Charakterystyczne piki CS pojawiły się przy 2,00 ppm (-COCH₃-) i 3,30–4,80 ppm (pierścień cukrowy). Charakterystyczne piki HDA znaleziono przy 0,80 ppm (-CH₃) i 1,20 ppm (-(CH₂)_n-) w widmie CS-HDA, co wskazuje na pomyślne przyłączenie HDA do łańcucha bocznego CS.

Czy nanotechnologia zrewolucjonizuje dostarczanie leków?

Badacze zsyntetyzowali CS-HDA o 10%, 20% i 30% stopniach podstawienia. Wyniki badań wykazały, że wraz ze wzrostem stopnia podstawienia CS-HDA, CMC (krytyczne stężenie micelarne) mieszanych miceli stopniowo maleje. Poprzez eksperymenty wychwytu komórkowego i dystrybucji u myszy z włóknieniem wątroby potwierdzono, że wraz ze wzrostem stopnia podstawienia, aktywowane komórki HSC-T6 i HepG₂ pobierały więcej nanocząstek DID-CS. Ostatecznie wybrano CS-HDA o stopniu podstawienia 30% do przygotowania IM-CS NPs do dalszych badań.

Czy IM-CS NPs działają efektywnie in vitro?

Nanocząsteczki IM-CS NPs zostały przygotowane metodą emulsyfikacji i odparowania rozpuszczalnika. Zarówno IM NPs, jak i IM-CS NPs miały podobny nanometrowy rozmiar cząstek, co wskazuje, że łańcuch boczny CS-HDA o wysokim stopniu podstawienia może dobrze wnikać do hydrofobowego rdzenia nanocząstki i ma niewielki wpływ na rozmiar cząstek. Obrazy TEM pokazały, że IM NPs i IM-CS NPs miały prawie kulisty kształt i rozmiar mniejszy niż 80 nm. Tak małe rozmiary cząstek (<100 nm) zapewniają, że nanocząsteczki mogą łatwiej dotrzeć do aHSC.

Wyniki były bardzo obiecujące. Badania in vitro wykazały, że IM-CS NPs były selektywnie pobierane przez komórki z wysoką ekspresją receptorów CD44, a intensywność fluorescencji aktywowanych komórek HSC-T6 inkubowanych z nanocząsteczkami była około dwukrotnie wyższa niż w przypadku komórek RAW_264.7. Co więcej, testy cytotoksyczności pokazały, że żywotność komórek aHSC traktowanych IM-CS NPs była znacznie niższa niż w grupach traktowanych roztworem IM lub standardowymi nanocząsteczkami IM przy równoważnych stężeniach leku.

“Dokładnie przeciwną tendencję zaobserwowano w komórkach HUVEC” – zauważają naukowcy. “Było jasne, że komórki HUVEC traktowane roztworem IM miały najniższy wskaźnik przeżycia, podczas gdy cytotoksyczność była znacznie zmniejszona w komórkach HUVEC traktowanych IM NPs i IM-CS NPs.”

Jak nanocząsteczki wnikają do aktywowanych HSC?

Wyniki te pokazują, że IM-CS NPs mogą selektywnie zabijać aHSC in vitro i mają działanie ochronne na normalne komórki, takie jak HUVEC. Ponadto, IM-CS NPs zmniejszały wydzielanie kolagenu po celowanym dostarczeniu imatynibu do aHSC, co potwierdzono eksperymentami immunofluorescencyjnymi.

Badania nad mechanizmem, poprzez który nanocząsteczki IM-CS wchodzą do komórek, wykazały, że preinkubacja w temperaturze 4°C wywoływała najbardziej znaczącą redukcję wychwytu (73,6%), a następnie siarczan dekstranu (66,8%), siarczan chondroityny (58,7%), przeciwciało CD44 (55,6%), nystatyna (51,5%), chlorpromazyna (12,4%), metylo-β-cyklodekstryna (6%) i amiloryd (5,5%). Wychwyt IM-CS NPs w aktywowanych komórkach HSC-T6 inkubowanych w 4°C był prawie całkowicie zahamowany, co sugeruje, że pobieranie nanocząstek CS jest głównie zależnym od energii transportem aktywnym.

“Metylo-β-cyklodekstryna i amiloryd nie miały wpływu na wychwyt aktywowanych HSC-T6, podczas gdy siarczan chondroityny, przeciwciało CD44, siarczan dekstranu, chlorpromazyna i nystatyna znacząco zmniejszyły wychwyt komórek HSC-T6” – wyjaśniają badacze. Wyniki te pokazują, że głównym sposobem wnikania nanocząstek IM-CS do aHSC jest endocytoza zależna od energii, pośredniczona przez CD44, klatrynę i kaweoliny.

Czy nowa formuła poprawia farmakokinetykę leku w organizmie?

W badaniach in vivo, IM-CS NPs znacząco przedłużały czas krążenia imatynibu we krwi i selektywnie gromadziły się w wątrobie. Badania farmakokinetyczne wykazały, że czas krążenia in vivo i pole pod krzywą (AUC) IM-CS NPs były wyższe niż w przypadku roztworu IM i standardowych nanocząsteczek IM, co stanowi podstawę farmakokinetyczną do zastosowania IM-CS NPs w leczeniu włóknienia wątroby.

Aby lepiej zbadać celowanie w wątrobę IM-CS NPs, badacze zbadali dystrybucję trzech grup czynników fluorescencyjnych (roztwór, standardowe nanocząsteczki i nanocząsteczki CS) u myszy z włóknieniem wątroby za pomocą systemu IVIS. Półilościowa analiza dystrybucji in vivo w punktach czasowych 2, 6, 12 i 24 godziny wykazała, że intensywność fluorescencji wątroby w grupie leczonej nanocząsteczkami CS była 1,76 i 2,35 razy wyższa niż w pozostałych dwóch grupach po 2 godzinach, podczas gdy wyniki były podobne po 6, 12 i 24 godzinach.

Jak potwierdzono selektywność celowania w wątrobę?

Badacze wykorzystali barwienie immunofluorescencyjne do zbadania ekspresji receptorów CD44 w wątrobach z włóknieniem. Aktywowane HSCs były znakowane fluorescencyjnie przeciwciałem α-SMA, komórki progenitorowe wątroby (HPCs) były znakowane fluorescencyjnie przeciwciałem HNF-4α, komórki Kupffera były znakowane fluorescencyjnie przeciwciałem F4/80, a komórki śródbłonka zatok wątrobowych (HSECs) były znakowane fluorescencyjnie przeciwciałem CD31. Wyniki pokazały, że receptory CD44 są głównie wyrażane na aHSC, a niewielka ilość na komórkach Kupffera.

Zbadano również selektywność nanocząstek CS dla aHSC poprzez kolokalizację barwnika DID z receptorami CD44 w każdym preparacie. “W grupie DID-CS NP czerwone światło i zielone światło prawie całkowicie się nakładają, a czerwone światło nie jest dystrybuowane do obszarów innych niż te zielone” – raportują badacze. “Pokazuje to, że IM-CS NPs mają doskonałe celowanie w aHSC i prawie nie dystrybuują się do innych hepatocytów.”

W przeciwieństwie do tego, roztwór DID i standardowe nanocząsteczki DID były dystrybuowane do innych miejsc niż aHSC. Podsumowując, nanocząsteczki CS wykazują doskonałe celowanie w aHSC in vivo i mogą służyć jako doskonały nośnik celujący w aHSC o dużym potencjale w leczeniu przeciwzwłóknieniowym wątroby.

Czy IM-CS NPs skutecznie zwalcza włóknienie?

Co najważniejsze, po podaniu dożylnym IM-CS NPs wykazywały wyraźny efekt przeciwzwłóknieniowy u myszy z indukowanym CCl₄ włóknieniem wątroby, przy minimalnej cytotoksyczności imatynibu dla innych narządów. Wątroby myszy leczonych IM-CS NPs wykazywały gładką powierzchnię podobną do wątrób zdrowych myszy, bez chropowatych cząstek. Barwienia H&E i Sirius Red również wykazały, że istniało tylko niewielkie odkładanie kolagenu i ECM, co silnie udowodniło, że IM-CS NPs mogą wywierać dobry efekt przeciwzwłóknieniowy.

Półilościowa analiza pozytywnego wskaźnika barwienia Sirius Red również przyniosła wyniki pokazujące tę samą tendencję. Po rozwoju włóknienia wątroby, wydziela ona dużą ilość ECM, co powoduje, że wątroba staje się cięższa. W porównaniu do zdrowej grupy, indeks masy wątroby był podwyższony po leczeniu solą fizjologiczną. W kilku innych grupach leczonych różnymi formulacjami, indeks masy wątroby zmniejszył się w różnym stopniu, a indeks masy wątroby w grupie IM-CS NP zmniejszył się najbardziej wyraźnie i był zbliżony do indeksu zdrowej grupy.

Wiele wskaźników biochemicznych w surowicy odzwierciedla nasilenie włóknienia wątroby. U myszy z włóknieniem wątroby poziomy ALT i AST w surowicy były znacznie podwyższone. W porównaniu z grupą leczoną solą fizjologiczną, ALT i AST były niższe w grupie leczonej IM-CS NP i były najbardziej zbliżone do poziomów występujących u normalnych myszy.

Gdy włóknienie wątroby występuje, spoczynkowe HSCs są aktywowane i wydzielają duże ilości ECM, aHSCs specyficznie wyrażają białko α-SMA, a ECM jest zdominowane przez kolagen typu I. Zdrowa grupa nie miała ekspresji α-SMA. Jednak grupa kontrolna miała znaczącą ekspresję α-SMA, wskazując, że masowa liczba HSCs została aktywowana. Liczba aHSCs w grupie leczonej IM-CS NP była mniejsza niż w pozostałych trzech grupach modelowych; barwienia kolagenu typu I również przyniosły wyniki pokazujące tę samą tendencję. Podsumowując, IM-CS NPs mogły hamować aktywację HSCs i wywierać znaczący efekt przeciwzwłóknieniowy.

Jak zmienia się stan zapalny przy terapii IM-CS NPs?

Podczas rozwoju włóknienia wątroby występuje proliferacja i infiltracja komórek zapalnych oraz wydzielanie różnych czynników zapalnych. Badacze ocenili następujące wskaźniki za pomocą barwienia immunohistochemicznego, aby ocenić stopień stanu zapalnego podczas włóknienia wątroby: IL-1β, IL-6, antygen Ki67 i TNF-α. Wyniki pokazały, że w grupie kontrolnej było dużo brązowo-żółtych precypitatów, podczas gdy po podaniu roztworu IM, standardowych nanocząsteczek IM i IM-CS NPs, brązowo-żółte precypitaty zostały zredukowane. Co więcej, myszy leczone IM-CS NPs miały najniższą odpowiedź zapalną w tkance wątroby.

Cytokiny TGF-β1 i PDGF odgrywają bardzo ważną rolę w aktywacji HSCs. Badacze użyli barwienia immunohistochemicznego do scharakteryzowania poziomów PDGF i Western blot do scharakteryzowania poziomów TGF-β1 w każdej grupie. Wartości skali szarości TGF-β1 i pozytywność PDGF w grupie kontrolnej były znacznie większe niż w zdrowej grupie, podczas gdy po leczeniu IM-CS NPs, poziomy TGF-β1 i PDGF zostały zredukowane, wskazując, że IM-CS NPs mogą zmniejszyć aktywację HSCs poprzez hamowanie wydzielania TGF-β1 i PGDF, wywierając tym samym dobry efekt przeciwzwłóknieniowy.

Jak bezpieczne są IM-CS NPs?

Nie mniej istotnym aspektem badania była ocena bezpieczeństwa IM-CS NPs. “Bezpieczeństwo systemów celowanego dostarczania leków jest ważnym czynnikiem w ich zdolności do rozwoju i zastosowania, a badanie bezpieczeństwa IM-CS NPs jest kluczowe dla oceny ich wartości dla zastosowania klinicznego” – podkreślają autorzy.

Wyniki rutynowej analizy krwi wykazały, że IM-CS NPs mają wysoki profil bezpieczeństwa u myszy, a barwienia H&E wykazały, że IM-CS NPs nie mają znaczącej toksyczności dla głównych narządów. Jest to szczególnie ważne, biorąc pod uwagę, że konwencjonalna terapia imatynibem wiąże się ze zwiększoną toksycznością dla innych tkanek, zwłaszcza skóry, płuc i serca.

Co dalej z terapią przeciwzwłóknieniową?

Podsumowując, badacze stworzyli nanocząsteczki ładowane imatynibem do terapii przeciwzwłóknieniowej w oparciu o nowy projekt i zsyntetyzowali amfifilowy siarczan chondroityny jako nośnik, aby zwiększyć skuteczność dostarczania leku celowanego w aHSC i wynik terapeutyczny dla włóknienia wątroby.

Wyniki tego badania potwierdzają hipotezę, że amfifilowy CS może zwiększyć efektywność enkapsulacji imatynibu, a także zwiększyć akumulację leku w aHSC. To zwiększenie można przypisać dwóm czynnikom: endocytozie pośredniczonej przez CD44 i małemu rozmiarowi cząstek (85–95 nm) CS. Dodatkowo, IM-CS NPs wykazały doskonałą zdolność przeciwzwłóknieniową in vitro poprzez podwójne hamowanie szlaków sygnałowych TGF-β i PDGF, przywracając aHSC do stanu spoczynku.

Co ważniejsze, po wstrzyknięciu do żyły ogonowej, IM-CS NPs wykazały znaczące efekty przeciwzwłóknieniowe w modelu myszy indukowanym CCl₄, z minimalną cytotoksycznością indukowaną imatynibem dla narządów, w tym wątroby.

Jednym słowem, badanie to nie tylko podkreśla obiecującą strategię leczenia włóknienia wątroby, ale także dostarcza nowego spojrzenia na rozwój przyszłych systemów dostarczania nanoleków przeciwzwłóknieniowych. Z niecierpliwością czekamy na dalsze badania kliniczne, które mogą przynieść tę innowacyjną terapię pacjentom cierpiącym na przewlekłe choroby wątroby.

Podsumowanie

Naukowcy opracowali przełomowy system dostarczania leku przeciwnowotworowego imatynibu, wykorzystując nanocząsteczki oparte na amfifilowym siarczanie chondroityny (CS-HDA). System ten został zaprojektowany w celu skutecznego leczenia włóknienia wątroby poprzez selektywne celowanie w aktywowane komórki gwiaździste wątroby (aHSC). Nanocząsteczki o rozmiarach 85-95 nm wykazały doskonałą zdolność do akumulacji w docelowych komórkach dzięki endocytozie pośredniczonej przez receptory CD44. Badania in vitro i in vivo potwierdziły wysoką skuteczność przeciwzwłóknieniową poprzez hamowanie szlaków sygnałowych TGF-β i PDGF, przy jednoczesnym zachowaniu minimalnej toksyczności dla innych narządów. System znacząco poprawił farmakokinetykę imatynibu i jego dystrybucję w organizmie. Przeprowadzone testy bezpieczeństwa potwierdziły wysoki profil bezpieczeństwa nowej formulacji, co stanowi znaczący postęp w porównaniu do konwencjonalnej terapii imatynibem.

Bibliografia

Liu Xunzhi, Fang Changlong, Yu Hongling, Huang Lu, Feng Jiaxing, Luo Shiqin, Song Li, Wu Mengying, Tan Yulu, Dong Jianxia, Gong Tao and Xiao Peihong. Chondroitin Sulfate-Based Imatinib Nanoparticles Targeting Activated Hepatic Stellate Cells Against Hepatic Fibrosis. Pharmaceutics 2025, 17(3), 472-489. DOI: https://doi.org/10.3390/pharmaceutics17030351.