Nowa metoda wykrywania pęcherzyków nowotworowych w diagnostyce onkologicznej

Czy nowe strategie wykrywania tdEVs zmieniają onkologiczną diagnostykę?

Zewnątrzkomórkowe pęcherzyki nowotworowe mogą być wykrywane za pomocą specyficznego markera glikozylacyjnego – przełomowe badanie otwiera drogę do płynnych biopsji w diagnostyce onkologicznej.

Zewnątrzkomórkowe pęcherzyki (ang. extracellular vesicles, EVs) to otoczone błoną cząstki uwalniane przez wszystkie komórki organizmu. Rosnąca liczba dowodów sugeruje, że pęcherzyki pochodzenia nowotworowego (ang. tumor-derived EVs, tdEVs) przyczyniają się do narządowo-specyficznych przerzutów i progresji choroby. Ponadto, EVs zyskały uwagę ze względu na ich potencjał jako biomarkery z płynnych biopsji oraz jako nośniki środków terapeutycznych. Jednak ich wykrywanie i analiza są trudne ze względu na niewielkie rozmiary (od około 30 nm do kilku mikrometrów), niską zawartość biomolekuł w porównaniu z komórkami oraz brak specyficznych markerów nowotworowych umożliwiających ich identyfikację. Międzynarodowy zespół badaczy opracował nowatorską metodę identyfikacji tdEVs, wykorzystując specyficzną modyfikację glikozylacyjną charakterystyczną dla komórek nowotworowych.

“Zmiany glikozylacyjne w nowotworach są uważane za jeden z wyznaczników raka. Ponieważ te modyfikacje potranslacyjne występują na wielu różnych białkach, potencjalnie oferują bogactwo nowych epitopów wystawionych na powierzchni krążących pęcherzyków pochodzenia nowotworowego” – piszą autorzy badania.

Kluczowym odkryciem jest fakt, że specyficzny glikozoaminoglikan, zwany onkopłodową siarczanową chondroityną (oncofoetal Chondroitin Sulphate, ofCS), występuje powszechnie w tkankach nowotworowych, przy ograniczonej ekspresji w zdrowych tkankach (z wyjątkiem łożyska). OfCS może być wykrywany przez rekombinowaną wersję białka pasożyta malarii VAR2CSA (rVAR2) lub przez niedawno opracowane przeciwciało C9, z wysoką specyficznością i nanomolarnym powinowactwem.

Wcześniejsze badania wykazały wszechobecność ofCS w tkankach złośliwych oraz jego ograniczoną ekspresję w zdrowych tkankach. Wykorzystano go już jako biomarker krążący w nowotworach – proteoglikany niosące ofCS były używane do wykrywania pan-nowotworowego w osoczu oraz wykrywania raka pęcherza moczowego w próbkach moczu. Ponadto, ofCS wykorzystano do identyfikacji i izolacji krążących komórek nowotworowych (CTCs) z szerokiego zakresu nowotworów, w tym glejaka wielopostaciowego, raka prostaty, jelita grubego, wątroby oraz gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC). Choć obiecujące, niska częstotliwość lub nawet brak CTCs w rutynowych pobraniach krwi od pacjentów z nowotworami ograniczyła ich użyteczność kliniczną. W przeciwieństwie do tego, sugeruje się, że krążące tdEVs są liczniejsze niż CTCs.

W badaniu wykazano, że białko rVAR2 sprzężone z fluoroforem skutecznie wiąże się do ofCS na powierzchni pęcherzyków nowotworowych. Wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną super-rozdzielczą (dSTORM, Airyscan FM) oraz cytometrię przepływową (FCM), badacze zidentyfikowali tdEVs z hodowli komórkowych różnych linii nowotworowych oraz z próbek osocza pacjentów z gruczolakorakiem przewodowym trzustki (PDAC).

Aby potwierdzić specyficzność wiązania rVAR2 do ofCS na tdEVs, zastosowano kilka kontroli. Traktowanie enzymatyczne chondroitynazą ABC (chABC), która selektywnie trawi siarczanową chondroitynę, prawie całkowicie znosiło wiązanie rVAR2, ale nie wpływało na wiązanie przeciwciała anty-CD81 (standardowego markera EV). Podobne wyniki uzyskano przy użyciu zmutowanej wersji rVAR2 o zmniejszonym wiązaniu do ofCS. Co istotne, zastosowanie detergentu (NP40), który częściowo lizuje błony pęcherzyków, również zmniejszało liczbę cząstek rVAR2+, potwierdzając, że wykrywany sygnał pochodził z nienaruszonych pęcherzyków.

Badacze wykazali również, że ofCS jest zachowany na tdEVs po przejściu komórek przez transformację nabłonkowo-mezenchymalną (EMT) – proces, który ułatwia przerzutowanie i oporność na terapię. To kluczowe odkrycie oznacza, że wykrywanie tdEVs nie jest ograniczone do pęcherzyków z komórek o fenotypie nabłonkowym, co znacznie rozszerza możliwości kliniczne tej metody. Aby ocenić, czy ofCS na tdEVs jest zachowany podczas EMT, komórki raka płuc A549 stymulowano rekombinowanym ludzkim transformującym czynnikiem wzrostu-β3 (TGF-β) w celu indukcji EMT. Badacze potwierdzili indukcję EMT w komórkach A549 po stymulacji TGF-β, oceniając zmiany w morfologii komórek oraz ekspresji markerów nabłonkowych i mezenchymalnych. Mimo tej transformacji, ofCS pozostał obecny na tdEVs zarówno z komórek nieleczonych, jak i traktowanych TGF-β.

Interesujące wyniki uzyskano badając obecność ofCS na EVs pochodzących z różnych linii nowotworowych. Najwyższy sygnał rVAR2 zaobserwowano w EVs z agresywnych i przerzutujących komórek nowotworowych (A375 – czerniak, Colo205 – rak jelita grubego, ES-2 – rak jajnika i U-87 MG – glioblastoma), podczas gdy EVs z nieprzerzutujących komórek MCF-7 (rak piersi) nie wykazywały wykrywalnego barwienia rVAR2. EVs z niezłośliwych linii komórkowych, takich jak MCF10A i HaCaT, wykazywały ogólnie niższe barwienie rVAR2. Zaobserwowano niski poziom wiązania rVAR2 do niektórych niezłośliwych EVs, szczególnie tych pochodzących z komórek HMEC.

Aby ocenić potencjał rVAR2 w wykrywaniu tdEVs w warunkach klinicznych, badacze najpierw sprawdzili możliwość detekcji EVs z komórek A549 dodanych do osocza zdrowych dawców. Wyniki potwierdziły, że rVAR2 skutecznie wiąże się do tdEVs nawet w złożonej matrycy osocza. Następnie zbadano ekspresję ofCS na komórkach raka trzustki PANC-1 i ich EVs. Barwienie rVAR2 komórek PANC-1 wykazało znaczną zmienność, przy czym niektóre komórki nie wykazywały ofCS. EVs pochodzące z komórek PANC-1 były wyraźnie mniej liczne niż EVs CD81+.

Jak wyniki badań wpływają na potencjalne zastosowania kliniczne?

“Nasze badanie pokazuje obecność ofCS na tdEVs pochodzących z linii komórek nowotworowych, a także w osoczu pacjentów z PDAC. Prezentujemy nowatorską metodę wykrywania tdEVs poprzez celowanie w ofCS za pomocą rVAR2 lub przeciwciała C9. Podejście to może potencjalnie być wykorzystane do wykrywania, izolowania i charakteryzowania tdEVs nie tylko z PDAC, ale także z innych typów nowotworów” – podsumowują autorzy.

Jakie są potencjalne zastosowania kliniczne tej metody? Przede wszystkim wczesne wykrywanie nowotworów poprzez analizę płynnej biopsji. Obecność ofCS+ EVs w osoczu mogłaby służyć jako biomarker nowotworowy, szczególnie cenny w przypadku nowotworów trudnych do wczesnego wykrycia, takich jak rak trzustki. Ponadto, metoda ta mogłaby być wykorzystana do monitorowania odpowiedzi na leczenie i progresji choroby, a także do izolowania i charakteryzowania tdEVs w celu lepszego zrozumienia ich funkcji w progresji nowotworowej.

Badanie ma jednak pewne ograniczenia. Sygnał rVAR2+ nie został całkowicie zniesiony po traktowaniu NP-40, co może wynikać z niepełnej lizy EVs. Fragmenty EV mogą nadal zachowywać znakowane epitopy ofCS, a ich intensywność fluorescencji może przekraczać próg wykrywania systemów detekcji. W przeciwieństwie do tetraspanin, które występują w niższych gęstościach, ofCS jest wystawiany na wielu białkach, co skutkuje większą obfitością epitopów i potencjalnie wykrywalną pozostałą fluorescencją po częściowej lizie. Ponadto, nie można wykluczyć możliwości, że w obecności rVAR2 dochodzi do multimeryzacji wolno krążących proteoglikanów modyfikowanych ofCS.

Innym ograniczeniem jest fakt, że wykrywalny sygnał był również obecny w osoczu zdrowych osób, co w niektórych przypadkach różniło się między dniami pomiarowymi. Różnica ta może wynikać z ręcznego przetwarzania próbek, na przykład podczas koniugacji rVAR2-fluorofor i usuwania agregatów. Dodatkowo, sygnał rVAR2 w zdrowym osoczu może wynikać z niespecyficznego lub niskopowinnościowego wiązania rVAR2. Aby rozwiązać ten problem, badacze przetestowali nowo opracowany fragment przeciwciała (C9) przeciwko ofCS. Zaobserwowali, że barwienie C9 zdrowego osocza ma niższy sygnał tła niż rVAR2, zachowując jednocześnie zdolność wiązania do EVs pochodzących z komórek ES-2 dodanych do osocza.

Czy metoda ta może zrewolucjonizować diagnostykę onkologiczną? Jest to obiecujące narzędzie, ale wymaga dalszych badań na większych grupach pacjentów z różnymi typami i stadiami nowotworów oraz u pacjentów z łagodnymi zmianami, aby ocenić ogólną stosowalność ofCS jako pan-nowotworowego markera tdEV. Niemniej jednak, wyniki te otwierają nowe możliwości w dziedzinie płynnych biopsji i diagnostyki nowotworowej.

Warto zauważyć, że podczas gdy ten artykuł był w recenzji, inna grupa badawcza (Zhao i wsp., 2025) również wykazała potencjał diagnostyczny ofCS+ EVs w osoczu PDAC, używając cytometrii przepływowej opartej na kulkach sprzężonych z rVAR2, poprzedzonej ultrawirówaniem. Potwierdza to znaczenie i potencjał kliniczny tej metody w diagnostyce onkologicznej.

Podsumowanie

Naukowcy opracowali nowatorską metodę wykrywania pęcherzyków pochodzenia nowotworowego (tdEVs) wykorzystując specyficzny marker glikozylacyjny ofCS. Marker ten występuje powszechnie w tkankach nowotworowych, przy jednoczesnej ograniczonej ekspresji w zdrowych tkankach. Do jego wykrywania wykorzystuje się rekombinowaną wersję białka VAR2CSA lub przeciwciało C9. Badania wykazały skuteczność metody w identyfikacji tdEVs z różnych linii nowotworowych oraz z próbek osocza pacjentów z rakiem trzustki. Szczególnie istotne jest zachowanie markera ofCS na tdEVs po transformacji nabłonkowo-mezenchymalnej, co poszerza możliwości diagnostyczne. Metoda wymaga jednak dalszych badań klinicznych, szczególnie w kontekście niespecyficznych sygnałów w próbkach osocza zdrowych osób. Niemniej jednak, stanowi ona obiecujące narzędzie w rozwoju płynnych biopsji i wczesnej diagnostyce nowotworowej.