Przełomowa metoda wykrywania komórek nowotworowych w krwi

Czy nowatorska metoda wykrywania CTCs zmienia podejście diagnostyczne?

Badanie przedstawia innowacyjną metodę wykrywania krążących komórek nowotworowych (CTCs) w próbkach krwi, opierającą się na białku rVAR2 sprzężonym z dekstranem znakowanym fluorescencyjnie. Technika ta umożliwia identyfikację komórek nowotworowych poprzez wykrywanie onko-płodowego siarczanu chondroityny (ofCS), specyficznej glikozaminoglikanu obecnej na powierzchni komórek nowotworowych.

Przeprowadzone badanie ma charakter translacyjny, z fazą in vitro oraz kliniczną walidacją metody. Naukowcy najpierw potwierdzili specyficzność metody na liniach komórkowych wywodzących się z różnych typów nowotworów (płuca – A549, jajnika – ES-2, jelita grubego – COLO205). Wykazano, że rVAR2:dekstran wiąże się z komórkami nowotworowymi w sposób zależny od stężenia, podczas gdy wiązanie do zdrowych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMCs) było minimalne. Specyficzność wiązania potwierdzono poprzez zastosowanie zmutowanej wersji białka rVAR2, która nie wykazywała wiązania do komórek nowotworowych.

Kluczowym elementem badania było potwierdzenie, że wiązanie rVAR2:dekstran jest specyficzne dla łańcuchów siarczanu chondroityny (CS), a nie innych pokrewnych struktur. Trawienie enzymatyczne CS za pomocą chondroitynazy ABC całkowicie eliminowało wiązanie rVAR2:dekstran do komórek nowotworowych, podczas gdy trawienie siarczanu heparanu (HS) nie miało wpływu na wiązanie. Dodatkowo, konkurencyjne blokowanie rozpuszczalnym CS hamowało wiązanie do komórek nowotworowych, podczas gdy rozpuszczalny HS miał niewielki wpływ.

Czy metoda rVAR2 przynosi kliniczne korzyści?

W kolejnym etapie badacze przetestowali zdolność metody do wykrywania komórek nowotworowych wprowadzonych do próbek krwi zdrowych dawców. Po dodaniu 10, 50 lub 100 komórek nowotworowych do 1 ml krwi, średni odzysk komórek nowotworowych przekraczał 50%, co wskazuje na wysoką czułość metody. Co istotne, odzysk był niezależny od liczby wprowadzonych komórek, potwierdzając przydatność metody do wykrywania rzadkich CTCs.

Kliniczną przydatność metody oceniono w dwóch niezależnych kohortach pacjentów: (i) z zaawansowanym nowotworem oraz (ii) z podejrzeniem, ale niezdiagnozowanym nowotworem. W grupie 28 pacjentów z zaawansowanym nowotworem, obejmującej 11 różnych typów nowotworów, ofCS+ CTCs wykryto u 24% pacjentów z rakami i u 100% pacjentów z nowotworami niepochodzenia nabłonkowego. Liczba wykrytych CTCs wahała się od 1 do 127 komórek na 4 ml krwi. Co ważne, nie wykryto ofCS+ komórek w próbkach krwi od 13 zdrowych dawców, podkreślając specyficzność metody.

Metoda umożliwiła wykrycie CTCs o różnorodnej morfologii, co wskazuje na jej zdolność do identyfikacji heterogennej populacji komórek nowotworowych. U pacjenta z przerzutowym rakiem jajnika wysokiego stopnia złośliwości zaobserwowano CTCs o różnych cechach morfologicznych, w tym: (1) CTCs o średnicy większej niż sąsiednie komórki krwi; (2) duże i wydłużone CTCs z wyraźnymi wypustkami komórkowymi; (3) skupiska CTCs składające się z więcej niż dwóch komórek; oraz (4) małe CTCs o średnicy porównywalnej z sąsiednimi komórkami krwi.

W kohorcie 80 pacjentów z niespecyficznymi objawami sugerującymi nowotwór, 11 pacjentów (13,75%) zostało zdiagnozowanych z nowotworem, w tym 4 z nowotworami hematologicznymi i 7 z guzami litymi. Analiza próbek krwi wykazała wykrywalne ofCS+ CTCs u 4 (57,1%) pacjentów z guzami litymi jelita grubego lub prostaty. Nie zaobserwowano wyraźnej korelacji między pozytywnością ofCS a stopniem zaawansowania nowotworu lub obecnością przerzutów.

Jakie wyzwania i ograniczenia wpływają na diagnostykę nowotworów?

Interesującym odkryciem było wykrycie ofCS+ CTCs u 6 z 69 pacjentów (8,7%), którzy nie otrzymali początkowej diagnozy nowotworu. Dwóch pacjentów miało wcześniej zdiagnozowany rak piersi lub chłoniak, ale nie zaobserwowano nawrotu w momencie pobierania krwi. Po 15 miesiącach od początkowych badań, u 2 z 69 pacjentów zdiagnozowano nowotwór, w tym u jednego pacjenta z przerzutowym rakiem podstawnokolczastokomórkowym, u którego wcześniej wykryto ofCS+ CTCs.

Istnieją przekonujące dowody łączące proces nowotworzenia z rozwojem płodowym, z którym dzieli wspólne cechy, takie jak różnicowanie komórek, proliferacja, migracja i wysoki stopień unikania odpowiedzi immunologicznej. W nowotworach, przeprogramowanie komórek złośliwych w kierunku fenotypu płodowego obejmuje ponowną ekspresję białek onkopłodowych lub glikozylacji, które normalnie są wyciszone w zdrowych tkankach dorosłych. Chociaż różne onkopłodowe białka osoczowe, takie jak alfa-fetoproteina czy antygen rakowo-płodowy (CEA), są rutynowo stosowane jako biomarkery w praktyce klinicznej, niewiele uwagi poświęcono markerom onkopłodowym jako strategii wykrywania CTCs.

Badanie ma pewne ograniczenia, w tym małą objętość analizowanej krwi (4 ml) w porównaniu do innych platform CTC, które standardowo wykorzystują 7,5 ml krwi. Ponadto, protokół obejmujący kilka etapów wirowania mógł prowadzić do utraty komórek. Metoda ma również ograniczenia w wykrywaniu CTCs w nowotworach hematologicznych, ponieważ komórki te często współwyrażają markery leukocytarne, co utrudnia ich odróżnienie od nienowotworowych komórek krwi.

Przed postawieniem diagnozy, ponad 25% pacjentów z nowotworem prezentuje szeroki zakres niespecyficznych objawów, których nie można powiązać z konkretnym układem narządów. Ta różnorodność objawów stanowi wyzwanie w opracowaniu skutecznego podejścia diagnostycznego, potencjalnie prowadząc do opóźnienia diagnozy lub wyników fałszywie ujemnych, gdy pacjent zostaje wypisany z kliniki diagnostycznej bez potwierdzonego rozpoznania nowotworu, tylko po to, by wrócić wkrótce potem z nowotworem.

Jakie perspektywy niesie ze sobą innowacyjna strategia wykrywania CTCs?

Podsumowując, celowanie w ofCS na CTCs za pomocą białka rVAR2 sprzężonego z dekstranem stanowi obiecującą metodę wykrywania CTCs w różnych typach nowotworów, niezależnie od ich pochodzenia tkankowego i fenotypu. W przyszłości strategia barwienia ofCS mogłaby potencjalnie zostać zaimplementowana w innych platformach CTC, oferując ulepszone wykrywanie CTCs niepochodzenia nabłonkowego i o fenotypie mezenchymalnym. Dodatkowo, ponieważ modyfikacja ofCS jest obecna na powierzchni komórki, strategia ta mogłaby również umożliwić identyfikację żywych CTCs do hodowli ex vivo lub profilowania transkryptomicznego, omijając potrzebę utrwalania komórek i barwienia wewnątrzkomórkowego, które wpływa na integralność RNA.

Podsumowanie

Przedstawiona metoda wykrywania krążących komórek nowotworowych (CTCs) wykorzystuje białko rVAR2 sprzężone z dekstranem znakowanym fluorescencyjnie do identyfikacji onko-płodowego siarczanu chondroityny (ofCS) na powierzchni komórek nowotworowych. Badania laboratoryjne potwierdziły wysoką specyficzność metody dla komórek nowotworowych przy minimalnym wiązaniu do zdrowych komórek krwi. W badaniach klinicznych metoda wykazała skuteczność w wykrywaniu CTCs u 24% pacjentów z rakami i 100% pacjentów z nowotworami niepochodzenia nabłonkowego. Technika umożliwia identyfikację heterogennej populacji komórek nowotworowych o różnej morfologii. Mimo pewnych ograniczeń, takich jak mała objętość analizowanej krwi czy trudności w wykrywaniu nowotworów hematologicznych, metoda stanowi obiecujące narzędzie diagnostyczne, szczególnie w kontekście wczesnego wykrywania nowotworów u pacjentów z niespecyficznymi objawami.